经验分享 细胞培养如何避免支原体感染

 

细胞培养技术广泛用于科研、教学、生物制品的研发和生产中。大规模培养细胞是一项基础工作,是整个生产工艺过程中的中心环节,这项技术受多种因素影响,防止污染是细胞培养成功的关键因素之一。

 

在体外细胞培养过程中,最常出现的就是支原体污染,其次是细菌和霉菌污染。那在细胞培养过程中如何避免出现支原体污染呢?

 

 

支原体长怎么样呢?

  • 直径约13~0.18μm
  • 没有细胞壁,细胞壁前体,有三层结构的单位膜,不能维持固定的形态而呈现多形性。
  • 普通染色法不易着色,Giemsa染色很浅,革兰氏染色为阴性。
  • 对干扰细胞壁合成的抗生素(青霉素)具抗性。
  • 生长需要核酸前体、氨基酸、脂肪酸。
  • 细胞膜存在甾醇,使之比其他原核生物的膜更坚韧。
  • 胆固醇含量占细胞膜的36%,对保持细胞膜的完整性具有一定作用。
  • 二性霉素B、皂素等作用于胆固醇的物质可引起支原体膜破坏、死亡。
  • 支原体感染发生后培养液清澈不浑浊,但pH值变化明显,培养液更换后几小时内变为酸性(颜色变黄)。
  • 污染初期,高倍镜下,细胞外形无明显变化但有细小黑色颗粒,不易被发现。
  • 支原体可与细胞共存,随着细胞换液而缓解,但细胞遭受支原体污染会抑制细胞生长,改变细胞的DNA/RNA及蛋白表达,降低细胞的转染效率。

怎样检测出培养细胞的支原体污染呢?

细胞培养中,支原体污染的发生率15%~80%,与细菌和真菌不同,在显微镜下看不见,几乎不显示它们的存在,而且目前没有一种简便快速方法能够检测培养物是否被支原体污染,原因之一是支原体分很多种,一种方法不能检测全部种属支原体;另一原因是检测技术的敏感性有限。检测细胞培养物中的支原体的方法有很多,都是针对病原性支原体的临床诊断,多数方法阳性率低,操作繁琐,需要使用精密仪器,进行支原体分离培养才能获得抗原。

电镜法检测

电镜下可见支原体多种增殖方式:二分裂繁殖;出芽繁殖。多分布在细胞周围和细胞间隙,有些则直接吸附在细胞表面膜上;在细胞基质内未见支原体存在。该技术快速、简便、省时省力,但敏感性不高,能作为筛查方法。对于可疑或阳性的细胞株,需要用其他方法检测。

 

荧光免疫法检测

用DAPI细胞核染色试剂与dsDNA结合,紫外光激发下释放强烈蓝色荧光对HEK细胞进行染色。

 

Image source: Nucleic Acid Ther. 2012 Feb; 22(1): 58-68. doi: 10.1089/nat.2011.0316

 

 

 

 

 

 

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