【文献解读】揭秘发5.7分细胞分子生物学SCI的套路

今天分享一篇澳洲莫纳什大学生殖健康中心Loveland博士课题组在《Human Reproduction》期刊上发表的WNT signalling in the normal human adult testis and in male germ cell neoplasms,影响因子为5.733分,属于中科院SCI 一区期刊。

doi:10.1093/humrep/deaa150

文章的关键术语
WNT signalling
spermatogenesis 精子发生
testicular germ cell tumor/TGCT睾丸生殖细胞瘤

研究主旨
本研究阐明了WNT信号通路在人睾丸中正常和肿瘤生殖细胞发挥的作用。这项研究采用了几种组织学方法,确立了参与WNT信号通路的蛋白在人睾丸中的表达定位图谱。同时Loveland博士课题组还鉴定出特定阶段和细胞类型是否直接受到WNT配体的影响。另外,该课题组还利用了TCam-2精原细胞瘤细胞系确定抑制信号通路的功能影响,以为筛选出治疗生殖细胞瘤的合适靶点。
WNT信号通路调控着各种生命活动的过程,包括生殖细胞生长发育。在肿瘤发生发展中,WNT信号通路的改变也发挥着一定作用,但目前尚未明确TGCTWNT通路的成分和功能。
研究思路
该课题组在组织、细胞、分子水平上通过免疫组化、原位杂交、PCR和细胞活力检测都做了验证,而且文章能吸引读者,原创性高,所以最终能发表在5.733分期刊上。

  1. 得到病人的知情同意后,收集睾丸癌组织样本以及正常睾丸组织样本,做石蜡包埋切片。
  2. 利用TCam-2SW480细胞系进行体外细胞培养。
  3. 反转录PCR得到CTNNB1AXIN2cDNA后,转导入DH5α细菌细胞,用菌落PCR筛选和测序进行验证。之后,制备好的石蜡切片用蛋白酶K处理,接着用cRNA探针做原位杂交。
  4. TCam-2细胞、SW480细胞和受精后12.5天的小鼠胚胎中分离出RNA,接着做Northern blot分析。
  5. 在正常睾丸组织和睾丸癌组织切片上做免疫组化分析,检测CTNNB1TCF7L1TCF7L2
  6. 细胞爬片和免疫荧光分析,检测CTNNB1TCF7L1TCF7L2TCam-2细胞的表达定位分布。
  7. siRNA实验:接种培养TCam-2细胞后,用RNAiMAX系统做转染,siRNA结合于TCF7L1TCF7L2并转染到TCam-2细胞中。未处理的TCam-2细胞和阴性对照siRNA作为对照。转染后135天后收集TCam-2细胞进行RNA分析。再用qRT-PCR做基因敲除鉴定。
  8. qRT-PCR实验:从TCam-2细胞中分离RNA,反转录成cDNA,然后上样跑PCR
  9. 细胞数量和细胞活力检测
  10. 细胞迁移实验

研究结果
在正常人睾丸切片上做原位杂交检测WNT通路的CTNNB1AXIN2的定位情况,发现典型的WNT通路在生精细胞中较为活跃。

免疫组化法检测睾丸生殖细胞瘤GCNIS切片上的WNT通路的信号分子CTNNB1WNT3ATCF-1TCF7L1TCF7L2的表达定位分布情况,发现CTNNB1蛋白主要存在于GCNIS的细胞质和支持细胞里,WNT3A则在支持细胞里表达量很少,但主要表达在生精小管周围的间质区域内。TCF-1GCNIS细胞核内和支持细胞都有表达。TCF7L1TCF7L2只表达在GCNIS细胞核内。

免疫组化检测精原细胞瘤上WNT通路信号分子的定位分布情况,发现了CTNNB1分布在细胞浆内。WNT3A分布在周围细胞之间,似乎表明了免疫浸润现象的出现。

这图表明了TCam-2细胞能够受WNT的刺激而作出反应,则会快速把CTNNB1在核内积累到一定程度。

以下这图表明了WNT拮抗剂显著影响了TCam-2细胞的生长发育和迁移,TCam-2WNT拮抗剂主要作用在通路的两个特定位点:IWR-1(破坏复合体的稳定性增加)以及CCT036477(抑制CTNNB1-TCF/LEF之间的相互作用)。

这图显示了抑制WNT信号通路能抑制TCam-2细胞的迁移,但当在5%血清培养时未必影响其细胞数量。

这图表明了抑制TCam-2细胞内TCF7L1TCF7L2的抑制会导致迁移能力的下降。

终上所述,这项研究提供了新的证据,表明WNT信号通路在正常的精子发生过程中保持活跃的状态,也在生殖细胞瘤内呈现出相关性。抑制生殖细胞瘤内的WNT通路会减弱细胞生存能力和迁移力,这可为日后使用小分子(siRNA)抑制剂作为治疗转移性TGCT提供有力的证据。

以上图片均来源于https://doi.org/10.1093/humrep/deaa150

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