蛋白质印迹实验常见问题及解决方案

Western Blot常见问题及解决方案

Western Blot故障排除:弱信号

弱蛋白质印迹信号的特征是微弱或不清楚的条带。虽然这些波段在预测的大小上几乎看不到,但弱信号通常需要重复实验。在蛋白质转移和检测期间发生该错误的常见来源。使用这些提示来确定错误的来源并获得更好的结果:

转移问题样品浓度不足增加起始材料的数量
使用免疫沉淀或类似程序浓缩样品
转移过于旺盛减少转移时间或电压,以防止小蛋白质完全通过膜转移
使用二级膜捕获通过初级膜转移的蛋白质
使用孔径较小的膜
转移不足增加传输时间或电压
三明治组件定向不正确确保夹层组件相对于电场正确定向
检查电场的极性
传输缓冲区PH不正确将转移缓冲液PH调节至比蛋白质样品的pI低2个点,以优化电荷:质量比
检测问题抗体浓度不足使用斑点印迹分析来优化蛋白质浓度
抗体结合亲和力不足降低洗涤严格性
增加抗体浓度
使用高亲和力一抗
样品加载不足使用更多的起始材料
装载前浓缩样品
抗原被干奶封闭溶液掩盖脱脂奶粉有时会掩盖抗原。尝试使用不同的封闭试剂

关键词:蛋白质印迹,故障排除,弱信号,低染色,微弱带

蛋白质印迹检测带错误的分子量

通常,聚丙烯酰胺凝胶电泳通过分子量分离蛋白质,大蛋白质比小蛋白质迁移慢。这个过程可能受到几个因素的影响:蛋白质降解会导致蛋白质出现短于预期的长度,糖基化可能导致蛋白质看起来比预测的更大,非特异性抗体结合可能导致多个条带出现在印迹上,其中只有一个是预期。使用这些提示可以识别并解决意外带宽大小的来源。

问题原因
频段的MW高于预期蛋白质是糖基化的或带有其他翻译后修饰查看文献并确定目标蛋白的修饰形式
用酶处理剥离翻译后修饰
乐队的MW高于预期蛋白质聚集降低蛋白质浓度
用新鲜的上样缓冲液准备新样品
不完全变性或残留的二硫键用尿素使蛋白质变性
使用更强的还原剂
使用新鲜的2-巯基乙醇或滴滴涕去除二硫键
频段的MW低于预期蛋白质样品已被消化或降解使用冷冻原料中的新鲜样品
使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液
一抗检测剪接变体回顾文献以确定蛋白质的剪接变体
尝试不同的一抗
一抗结合不同蛋白质上的相似表位运行阴性对照以检测与您的抗体反应的其他蛋白质
多个乐队被非特异性IgG污染的一抗或二抗使用一抗保证不含非特异性IgG
一抗的非特异性结合增加抗体稀释度
亲和纯化一抗以仅选择所需的结合活性
使用一抗确保仅结合其指定的靶标
二抗的非特异性结合降低抗体浓度
仅使用二抗运行阴性对照以检测非特异性结合
阻塞不足使用更高浓度的封闭缓冲液
阻止更长时间
将补间20添加到阻塞缓冲区
离子相互作用提高洗涤步骤的严格性
增加孵化缓冲液的盐浓度
在洗涤中加入更强的洗涤剂

关键词: Western Blot,故障排除,意外,带尺寸,MW,位置

Western Blot故障排除:背景问题

蛋白质印迹的背景并不总是显得干净无瑕。斑点,条纹和斑点都是常见的工件,可能难以解释和发布结果。这些伪影最常见的是缓冲液或抗体涂布不均匀,膜干燥或在抗体或封闭缓冲液中形成聚集体的结果。请遵循以下提示,以确定并解决不完美的蛋白质印迹背景的原因:

问题原因
Blotched背景抗体分布不均匀在孵育期间搅拌以在培养缓冲液中均匀地包被膜
膜不均匀地干燥在开始使用方案之前,确保膜完全润湿
确保膜在任何步骤中都不会变干
洗涤/孵化缓冲区覆盖率不均匀增加洗涤和孵育缓冲液的体积
孵化期间不要堆积膜
斑点的背景二抗聚集增加二抗稀释以防止聚集
旋转或过滤掉抗体聚集体
阻断缓冲液结合二抗的团块使用新的阻塞缓冲液
增加Tween 20浓度的封闭缓冲液
使用前过滤阻塞缓冲区
使用不同的封闭试剂,如白蛋白,BSA或酪蛋白
在抗体孵育之前用洗涤缓冲液洗涤膜
缓冲污染混合新的缓冲区
使用前过滤缓冲区
没有蛋白质转移的白点在转移过程中,气泡被夹在凝胶和膜之间使用无菌玻璃棒小心地从膜和凝胶之间挤出气泡
使用足够的缓冲液使膜饱和

关键词:蛋白质印迹,故障排除,斑点背景,斑点背景,斑点背景,条纹背景

Western Blot故障排除:高背景

通常,聚丙烯酰胺凝胶电泳通过分子量分离蛋白质,大蛋白质比小蛋白质迁移慢。这个过程可能受到几个因素的影响:蛋白质降解会导致蛋白质出现短于预期的长度,糖基化可能导致蛋白质看起来比预测的更大,非特异性抗体结合可能导致多个条带出现在印迹上,其中只有一个是预期。使用这些提示可以识别并解决意外带宽大小的来源。

问题原因
阻止问题膜堵塞太少增加封闭溶液的浓度
提高阻塞的温度
增加阻塞时间
阻断蛋白质与检测系统反应牛奶含有生物素; 用avadin-biotin系统检测时不要使用
尝试一下Boster的其他阻断试剂
受污染的阻塞解决方案切勿重复使用阻塞解决方案
使用纯蛋白质作为封闭剂
孵化问题过量的底物孵育减少底物孵育的长度
受污染的孵化设备使用一次性孵化托盘
在孵育之间彻底清洗可重复使用的培养盘
孵育之间的膜洗涤不充分增加洗涤严格性
孵化温度太高在较低温度下孵育较长时间
检测问题膜过度曝光检查曝光参数并尝试缩短曝光时间
抗体结合活性不足使用-20℃保存的新鲜抗体
避免解冻和重新冷冻抗体
将抗体储存在-80℃以保持长期稳定性
抗体浓度过高降低抗体浓度
使用斑点印迹测试来优化抗体浓度

关键词:蛋白质印迹,故障排除,高背景,非特异性染色,背景噪音,黑暗的背景

Western Blot故障排除:扭曲带

扭曲带可能会很难解释你的结果。常见的扭曲包括微笑形状的带,边缘向上延伸,漫射带宽或模糊,条纹带在几个方向上落后。按照以下提示确保您的下一个印迹具有均匀,清晰的条带:

问题原因
曲线,“微笑”乐队电泳电压太高降低电压; 慢慢运行凝胶以获得更一致的结果
过热的凝胶降低电压或在冰上或冷室(-4C)运行凝胶
条纹或漫射带转移过程中凝胶和膜之间不完全接触在三明治中使用较厚的滤纸
从膜和凝胶之间挤压气泡和多余的缓冲液
转移过程中膜的滑动在转移过程中避免搅动或移动凝胶或膜
模糊的乐队电泳电压太高在较低电压下运行凝胶更长时间
更糟糕的装载缓冲液成分混合新的上样缓冲液,或使用配制的上样缓冲液
在转移过程中,气泡被夹在凝胶和膜之间用无菌玻璃棒挤出气泡,小心地去除气泡
幽灵乐队可视化期间过度曝光减少曝光时间
加载样品太浓减少加载的样本量。有关负载优化提示,请参阅南博屹生物的Western blot 故障排除指南
抗体浓度太高使用抗体稀释培养基稀释您的抗体溶液
在转移过程中移动了污点在转移过程中避免搅动或移动凝胶或膜
不平衡,弯曲的乐队凝胶聚合不良检查凝胶浓度,确保在浇铸凝胶前完全溶解SDS
改变孔之间的盐浓度确保不同样品中的盐浓度相似

关键词:蛋白质印迹,故障排除,扭曲,条纹,模糊

 

 

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