Western Blot故障排除：弱信号
弱蛋白质印迹信号的特征是微弱或不清楚的条带。虽然这些波段在预测的大小上几乎看不到，但弱信号通常需要重复实验。在蛋白质转移和检测期间发生该错误的常见来源。使用这些提示来确定错误的来源并获得更好的结果：
| 转移问题 | 样品浓度不足 | 增加起始材料的数量 |
| 使用免疫沉淀或类似程序浓缩样品 | ||
| 转移过于旺盛 | 减少转移时间或电压，以防止小蛋白质完全通过膜转移 | |
| 使用二级膜捕获通过初级膜转移的蛋白质 | ||
| 使用孔径较小的膜 | ||
| 转移不足 | 增加传输时间或电压 | |
| 三明治组件定向不正确 | 确保夹层组件相对于电场正确定向 | |
| 检查电场的极性 | ||
| 传输缓冲区PH不正确 | 将转移缓冲液PH调节至比蛋白质样品的pI低2个点，以优化电荷：质量比 | |
| 检测问题 | 抗体浓度不足 | 使用斑点印迹分析来优化蛋白质浓度 |
| 抗体结合亲和力不足 | 降低洗涤严格性 | |
| 增加抗体浓度 | ||
| 使用高亲和力一抗 | ||
| 样品加载不足 | 使用更多的起始材料 | |
| 装载前浓缩样品 | ||
| 抗原被干奶封闭溶液掩盖 | 脱脂奶粉有时会掩盖抗原。尝试使用不同的封闭试剂 |
关键词：蛋白质印迹，故障排除，弱信号，低染色，微弱带
蛋白质印迹检测带错误的分子量
通常，聚丙烯酰胺凝胶电泳通过分子量分离蛋白质，大蛋白质比小蛋白质迁移慢。这个过程可能受到几个因素的影响：蛋白质降解会导致蛋白质出现短于预期的长度，糖基化可能导致蛋白质看起来比预测的更大，非特异性抗体结合可能导致多个条带出现在印迹上，其中只有一个是预期。使用这些提示可以识别并解决意外带宽大小的来源。
| 问题 | 原因 | 解 |
| 频段的MW高于预期 | 蛋白质是糖基化的或带有其他翻译后修饰 | 查看文献并确定目标蛋白的修饰形式 |
| 用酶处理剥离翻译后修饰 | ||
| 乐队的MW高于预期 | 蛋白质聚集 | 降低蛋白质浓度 |
| 用新鲜的上样缓冲液准备新样品 | ||
| 不完全变性或残留的二硫键 | 用尿素使蛋白质变性 | |
| 使用更强的还原剂 | ||
| 使用新鲜的2-巯基乙醇或滴滴涕去除二硫键 | ||
| 频段的MW低于预期 | 蛋白质样品已被消化或降解 | 使用冷冻原料中的新鲜样品 |
| 使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液 | ||
| 一抗检测剪接变体 | 回顾文献以确定蛋白质的剪接变体 | |
| 尝试不同的一抗 | ||
| 一抗结合不同蛋白质上的相似表位 | 运行阴性对照以检测与您的抗体反应的其他蛋白质 | |
| 多个乐队 | 被非特异性IgG污染的一抗或二抗 | 使用一抗保证不含非特异性IgG |
| 一抗的非特异性结合 | 增加抗体稀释度 | |
| 亲和纯化一抗以仅选择所需的结合活性 | ||
| 使用一抗确保仅结合其指定的靶标 | ||
| 二抗的非特异性结合 | 降低抗体浓度 | |
| 仅使用二抗运行阴性对照以检测非特异性结合 | ||
| 阻塞不足 | 使用更高浓度的封闭缓冲液 | |
| 阻止更长时间 | ||
| 将补间20添加到阻塞缓冲区 | ||
| 离子相互作用 | 提高洗涤步骤的严格性 | |
| 增加孵化缓冲液的盐浓度 | ||
| 在洗涤中加入更强的洗涤剂 |
关键词： Western Blot，故障排除，意外，带尺寸，MW，位置
Western Blot故障排除：背景问题
蛋白质印迹的背景并不总是显得干净无瑕。斑点，条纹和斑点都是常见的工件，可能难以解释和发布结果。这些伪影最常见的是缓冲液或抗体涂布不均匀，膜干燥或在抗体或封闭缓冲液中形成聚集体的结果。请遵循以下提示，以确定并解决不完美的蛋白质印迹背景的原因：
| 问题 | 原因 | 解 |
| Blotched背景 | 抗体分布不均匀 | 在孵育期间搅拌以在培养缓冲液中均匀地包被膜 |
| 膜不均匀地干燥 | 在开始使用方案之前，确保膜完全润湿 | |
| 确保膜在任何步骤中都不会变干 | ||
| 洗涤/孵化缓冲区覆盖率不均匀 | 增加洗涤和孵育缓冲液的体积 | |
| 孵化期间不要堆积膜 | ||
| 斑点的背景 | 二抗聚集 | 增加二抗稀释以防止聚集 |
| 旋转或过滤掉抗体聚集体 | ||
| 阻断缓冲液结合二抗的团块 | 使用新的阻塞缓冲液 | |
| 增加Tween 20浓度的封闭缓冲液 | ||
| 使用前过滤阻塞缓冲区 | ||
| 使用不同的封闭试剂，如白蛋白，BSA或酪蛋白 | ||
| 在抗体孵育之前用洗涤缓冲液洗涤膜 | ||
| 缓冲污染 | 混合新的缓冲区 | |
| 使用前过滤缓冲区 | ||
| 没有蛋白质转移的白点 | 在转移过程中，气泡被夹在凝胶和膜之间 | 使用无菌玻璃棒小心地从膜和凝胶之间挤出气泡 |
| 使用足够的缓冲液使膜饱和 |
关键词：蛋白质印迹，故障排除，斑点背景，斑点背景，斑点背景，条纹背景
Western Blot故障排除：高背景
通常，聚丙烯酰胺凝胶电泳通过分子量分离蛋白质，大蛋白质比小蛋白质迁移慢。这个过程可能受到几个因素的影响：蛋白质降解会导致蛋白质出现短于预期的长度，糖基化可能导致蛋白质看起来比预测的更大，非特异性抗体结合可能导致多个条带出现在印迹上，其中只有一个是预期。使用这些提示可以识别并解决意外带宽大小的来源。
| 问题 | 原因 | 解 |
| 阻止问题 | 膜堵塞太少 | 增加封闭溶液的浓度 |
| 提高阻塞的温度 | ||
| 增加阻塞时间 | ||
| 阻断蛋白质与检测系统反应 | 牛奶含有生物素; 用avadin-biotin系统检测时不要使用 | |
| 尝试一下Boster的其他阻断试剂 | ||
| 受污染的阻塞解决方案 | 切勿重复使用阻塞解决方案 | |
| 使用纯蛋白质作为封闭剂 | ||
| 孵化问题 | 过量的底物孵育 | 减少底物孵育的长度 |
| 受污染的孵化设备 | 使用一次性孵化托盘 | |
| 在孵育之间彻底清洗可重复使用的培养盘 | ||
| 孵育之间的膜洗涤不充分 | 增加洗涤严格性 | |
| 孵化温度太高 | 在较低温度下孵育较长时间 | |
| 检测问题 | 膜过度曝光 | 检查曝光参数并尝试缩短曝光时间 |
| 抗体结合活性不足 | 使用-20℃保存的新鲜抗体 | |
| 避免解冻和重新冷冻抗体 | ||
| 将抗体储存在-80℃以保持长期稳定性 | ||
| 抗体浓度过高 | 降低抗体浓度 | |
| 使用斑点印迹测试来优化抗体浓度 |
关键词：蛋白质印迹，故障排除，高背景，非特异性染色，背景噪音，黑暗的背景
Western Blot故障排除：扭曲带
扭曲带可能会很难解释你的结果。常见的扭曲包括微笑形状的带，边缘向上延伸，漫射带宽或模糊，条纹带在几个方向上落后。按照以下提示确保您的下一个印迹具有均匀，清晰的条带：
| 问题 | 原因 | 解 |
| 曲线，“微笑”乐队 | 电泳电压太高 | 降低电压; 慢慢运行凝胶以获得更一致的结果 |
| 过热的凝胶 | 降低电压或在冰上或冷室（-4C）运行凝胶 | |
| 条纹或漫射带 | 转移过程中凝胶和膜之间不完全接触 | 在三明治中使用较厚的滤纸 |
| 从膜和凝胶之间挤压气泡和多余的缓冲液 | ||
| 转移过程中膜的滑动 | 在转移过程中避免搅动或移动凝胶或膜 | |
| 模糊的乐队 | 电泳电压太高 | 在较低电压下运行凝胶更长时间 |
| 更糟糕的装载缓冲液成分 | 混合新的上样缓冲液，或使用配制的上样缓冲液 | |
| 在转移过程中，气泡被夹在凝胶和膜之间 | 用无菌玻璃棒挤出气泡，小心地去除气泡 | |
| 幽灵乐队 | 可视化期间过度曝光 | 减少曝光时间 |
| 加载样品太浓 | 减少加载的样本量。有关负载优化提示，请参阅南博屹生物的Western blot 故障排除指南 | |
| 抗体浓度太高 | 使用抗体稀释培养基稀释您的抗体溶液 | |
| 在转移过程中移动了污点 | 在转移过程中避免搅动或移动凝胶或膜 | |
| 不平衡，弯曲的乐队 | 凝胶聚合不良 | 检查凝胶浓度，确保在浇铸凝胶前完全溶解SDS |
| 改变孔之间的盐浓度 | 确保不同样品中的盐浓度相似 |
关键词：蛋白质印迹，故障排除，扭曲，条纹，模糊