WB(Western Blot)优化

Western Blot(WB,蛋白质免疫印迹)实验优化步骤、优化方法

Western Blot(WB)实验抗体浓度优化

每个Western印迹实验涉及在不同条件下与独特样品相互作用的独特抗体。没有单一抗体或抗原浓度适用于每个实验。为了获得最完美的Western印迹,需要优化抗体浓度。理想的抗体浓度取决于抗原浓度,抗体的特异性和亲和力,以及实验条件如缓冲液组成。

次优的抗体浓度可能导致几种常见错误,包括弱信号,非特异性条带和斑点或斑点背景。优化抗体浓度可以解决这些问题以及更多问题,但是进行多次Western印迹以获得最佳浓度是耗时且浪费的。更简单,更快速,更便宜的方法是使用斑点印迹试验。

Dot Blot Protocol

  1. 使用您选择的缓冲液准备一系列稀释的蛋白质样品,并准备您的抗体稀释液。
  2. 将硝酸纤维素膜切成1cm条,足以用两个或三个二抗稀释液测试一个或两个一抗稀释液。
  3. 使用尽可能少的体积将样品点到硝酸纤维素膜条上。要对大于5ul的样品进行点处,请在同一点上多次点样较小的体积,每次点都可以完全干燥。完成打点后,让膜条干燥10-15分钟。
  4. 通过在封闭缓冲液中在室温下浸泡1-2小时来阻断膜。使用振动筛确保均匀覆盖。
  5. 应用一抗稀释液,在轨道振荡器上孵育1小时。接受相同浓度的一抗的条带可以在同一浴中一起孵育。
  6. 在洗涤缓冲液中彻底清洗膜条。
  7. 以与以前相同的方式应用二抗稀释液。
  8. 再次清洗膜条,如步骤6
  9. 按照所用基材的数据表中所述准备基材工作溶液。
  10. 将硝酸纤维素条与基质工作溶液孵育5分钟,或直至出现颜色。
  11. 使用化学发光底物时,观察结果或用胶片或照相机拍摄图像。最佳蛋白质浓度将导致黑点或强化学发光信号持续5-20小时

 

Western Blotting膜阻断优化

蛋白质印迹阻断缓冲液优化

BSA与脱脂奶粉

蛋白质印迹的阻断步骤通过用非反应性蛋白质使膜饱和来防止抗体与膜的非特异性结合。最常见的封闭缓冲液包括在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液或tris缓冲盐水(TBS)溶液中的3-5%牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉。可以将少量洗涤剂吐温20添加到封闭溶液和洗涤溶液中以进一步减少背景染色。

为了从蛋白质印迹中获得最佳结果,您必须根据使用的检测系统和您试图检测的抗原决定使用哪种类型的阻断缓冲液。例如,PBS中的磷酸盐会干扰碱性磷酸盐检测系统,使得TBS阻断缓冲液成为更好的选择。

缓冲优点缺点
BSA阻塞缓冲区– 与所有检测系统和抗体兼容 –
允许更高的灵敏度检测
– 不抑制非特异性抗体结合
– 完全阻断
– 更昂贵
脱脂奶粉封闭缓冲液– 廉价- 更完全阻断 –
减少非特异性抗体结合
– 与磷酸抗体
不相容 – 与avadin /生物素检测系统不相容
Boster TBS阻断缓冲液– 最便宜 –
与所有抗体和检测系统兼容 –
允许高灵敏度检测
– 作为粉末的船只
– 不能交换到不同的缓冲区(例如PBS用于TBS)

 

 

 

Western Blotting蛋白转移(SDS-PAGE)优化

SDS-PAGE是最广泛使用的通过其相对分子量分离蛋白质的方法。通过在SDS(离子去污剂)存在下使蛋白质变性,蛋白质可以线性化并充满负电荷。这允许电场将它们压过聚丙烯酰胺凝胶基质。较大的蛋白质比小蛋白质迁移得慢,导致蛋白质的大小依赖性分离。为了获得完美的图像分离,必须将凝胶浓度和运行条件调整到所研究的蛋白质。

凝胶浓度

凝胶的浓度很大程度上取决于两个因素:所用丙烯酰胺的浓度,以及丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例。较高浓度的丙烯酰胺形成具有较小孔径的较稠密凝胶,这对于分离具有高分辨率的低分子量蛋白质是理想的。双丙烯酰胺负责在丙烯酰胺分子之间形成交联; 改变丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例可用于精细调节凝胶的孔径。

要考虑的其他因素包括具有不同孔径的凝胶。一个常见的例子是使用堆积凝胶和分辨凝胶; 堆积凝胶是低浓度凝胶,用于形成浓度高得多的溶解凝胶的孔。这允许更多蛋白质在分离之前在染料前端浓缩,允许在相同凝胶上比较不同浓度的蛋白质样品。

根据您尝试解决的蛋白质大小优化凝胶浓度。使用这个方便的表格来帮助您估算:

蛋白质MW范围凝胶浓度
100-600 kDa4%
50-500 kDa7%
30-300 kDa10%
10-200 kDa12%
3-10015%

 

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