Western blot实验方法、实验步骤\WB Protocol的工作流程、免疫印迹方法

Western Blot即蛋白质印迹法(免疫印迹试验),也称Western blotting实验,WB实验,它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法

1.    电泳

(A)凝胶制备

  • 凝胶制备的第一步是根据蛋白质分子量测定凝胶百分比:
蛋白质大小(kDa)> 20015-20010-7012-454-40
凝胶百分比6%8%10%12%20%
  • 如果您不确定蛋白质的大小或正在研究各种分子量的蛋白质,那么渐变凝胶可以提供最佳分辨率。
  • 笔记
    • 我们建议使用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒。它含有大部分用于凝胶制备的试剂,可分别用于制备SDS-PAGE凝胶和非天然PAGE凝胶。
    • 许多方案可用于凝胶制备。有关特定产品的使用,请参阅制造商的指南。
    • 也可以使用预制凝胶代替制作自己的凝胶。

(i)解决凝胶制备

  • 确定所需的体积并轻轻混合所选择的分辨凝胶百分比的成分。
  • 将溶液倒入凝胶浇注形式。
  • 用蒸馏水将凝胶顶部分层。
  • 等一下凝胶完全聚合30分钟。
  • 从聚合的分解凝胶中除去水分(用纸巾吸收多余的水分)。

(ii)堆叠凝胶制备

  • 确定所需的体积,轻轻混合成分,并将堆积凝胶倒在运行的凝胶上。
  • 插入样品梳(避免气泡)。
  • 允许30至60分钟进行完全凝胶聚合。

(B)预电泳样品制备

    • 将提取的蛋白质样品与4X双色蛋白质上样缓冲液,以3:1的比例混合(即,将300μg样品加入100μL上样缓冲液中)。双色蛋白质上样缓冲液旨在防止蛋白质在电泳前加热样品,并且能够在SDS-PAGE运行过程中对pH变化起作用(许多蛋白质对电泳过程中Tris缓冲液温度波动引起的pH变化敏感)。它含有两种跟踪染料:用于跟踪电泳进程的蓝色(Bromophenol Blue)和用于监测蛋白质向膜转移的粉红色(Pyronin Y)。有关更多信息,请参阅我们网站上的数据表。
    • 您也可以使用以下试剂/方法之一代替双色蛋白质上样缓冲液:
      – 2X SDS-PAGE蛋白质上样缓冲液,比例为1:1(即将100μg样品加入100μLLoadingBuffer)
      – 5X SDS-PAGE蛋白质上样缓冲液,比例为4:1(即加入400μg样品至100μL上样缓冲液)
      – 2X SDS-PAGE TricineProtein上样缓冲液,比例为1:1(即加入100μg)样品至100μL上样缓冲液)如果蛋白质具有低分子量(<10KD)
      – Laemmli 2X缓冲液(4%SDS,10%2-巯基乙醇,20%甘油,004%溴酚蓝,0.125M Tris-HCl; pH6.8)比例为1:1(即将100μg样品加入100μL上样缓冲液中)
    • 将样品/上样缓冲液混合物在100°C水浴中变性5分钟(或遵循制造商说明书); 或者,可以在使用前将混合物以等分试样在-20℃下储存数月或在4℃下储存1-2周。

(C)装载样品和运行电泳

    • 将凝胶放入电泳仪器中。
    • 用SDS-PAGE电泳缓冲液(25mM Tris碱,190mM甘氨酸和1%SDS; pH8.3)填充两个缓冲液室;
    • 用电泳缓冲液小心地从凝胶和冲洗液中取出产生良好的梳子。
    • 将样品快速吸入孔中以防止样品在孔内扩散(对于最大30μL的孔,每孔加载20至25μL的1μg/μL样品)。
    • 在单独的孔中移取10μL适当的对照和/或分子量标准品
    • 适当地连接电泳的阳极和阴极。
    • 打开电源,以100V / 130V *运行电泳,直到溴酚蓝染料到达凝胶底部(这可能需要5到3小时)。您应该观察到来自凝胶装置底部的细小气泡,因为该观察结果表明产生了足够的电流。
    • 当蛋白质样品完成在凝胶中迁移时关闭电源。

笔记:

  • 在不连续系统中,用于堆积凝胶的电泳电压低于用于分离凝胶的电泳电压,以确保蛋白质在进入分离凝胶之前集中在相同水平上。
  • *施加的电压应根据凝胶厚度,使用的电源和所需的分辨率进行调整。

2.    蛋白质转移(到膜)

(A)凝胶染色(可选)

电泳后,我们建议使用我们的凝胶染色溶液之一来确定电泳分离是否有效。有关更多信息,请参阅我们网站上的数据表。

  • 考马斯蓝染色和脱色溶液
  • 考马斯蓝快速染色解决方案
  • 蛋白质银染试剂

注意:染色凝胶不能用于随后的蛋白质转移过程。

(B)湿转移

  1. 印迹膜制备
    • 根据凝胶的大小切割印迹膜(NC或PVDF)(提示:提前切好供应的膜!存放在阴凉干燥的地方)。
    • 通过切割一个角或用铅笔标记,仔细标记膜的方向。
    • 将膜浸泡在甲醇中1分钟。
    • 用1X转移缓冲液(25mMTris碱,190mM甘氨酸和20%甲醇; pH 8.3)将膜浸泡5分钟,轻轻摇动膜直至其下沉并且水不再在表面上形成珠子。
  2. 转移盒式磁带
    • 基于三明治型号,按以下顺序安装电子转印盒:
      泡沫垫→滤纸→凝胶→膜→滤纸→泡沫垫:

      • 快速高效的转移垫,12.5 cm X 12.5 cm
      • 快速高效的转移垫,9 cm X 7.5 cm(
        • – 将两张滤纸浸泡在一个带有相同转移缓冲液的单独容器中
        • – 用刮刀打开转印盒并确保完全松开盒式磁带,然后小心地拉开两半(在使用凝胶做任何事情之前,例如切割它,注意通道的位置# 1)。
        • – 用剃刀刀片根据膜的大小切割凝胶,然后用#1道切割凝胶侧面的角落。
        • – 将凝胶浸入1X转移缓冲液中15-30分钟。
        • – 将转印盒的灰色或黑色板放在干净的表面上。
        • – 将一个预先润湿的泡沫垫放在盒子的灰色一侧。
        • – 将湿润的滤纸放在泡沫垫上。
        • – 小心地从剩余的一半凝胶盒上剥下凝胶并将其放在滤纸上(用转移缓冲液润湿凝胶,并使用血清学上干净的移液管或Falcon管,就像它是擀面杖一样,滚动气泡离开膜)。
        • – 将膜放在凝胶上,使角落匹配(一旦膜接触凝胶,就不应移动它或者可能产生“鬼带”)。
        • – 将一块滤纸放在膜上,完成三明治。
        • – 在滤纸顶部添加第二个泡沫垫。
        • – 使用白色闩锁牢牢锁定转印盒(小心不要移动凝胶和滤纸夹层,并确保泡沫垫,滤纸和膜完全浸没在转印缓冲液中)。
  3. iii)蛋白质转移运行
    • 用足量的1X转移缓冲液填充转移罐。
    • 将转印盒牢固地插入转印设备的插槽中。
    • 将盖子放在转移罐的顶部,确保电极正确排列(凝胶应靠近阴极;膜应靠近阳极。带负电荷的蛋白质将向阳极迁移)。
    • 将电源设置为恒定电压,并在25 V下运行30分钟*。
    • 通过膜染色检查蛋白质转移效率:将膜置于Ponceau S染色(2%w / v Ponceau S; 5%冰醋酸)或印迹膜快速可逆蛋白染色试剂中5-10分钟(将出现可见的红色条带;可以通过在洗涤缓冲液中反复洗涤来完全去除膜)。

笔记

  • 转移可以在较低的电压下完成,例如10V。
  • 应根据凝胶浓度优化转移时间和电压。凝胶浓度越高,需要更多时间。

3.    膜阻塞

  • 用TBS洗涤缓冲液(20mM Tris,5; 150mM NaCl; 0.05%吐温20)在室温下漂洗印迹膜3X,每次10分钟。
  • 漂洗后,将印迹膜浸入TBS封闭缓冲液(5%脱脂奶粉,20mM Tris缓冲液,pH 7.5; 150 mMNaCl)中,在室温下孵育5-2小时(或过夜4小时) °C)摇晃。或者,可以使用含有脱脂奶粉,明胶或BSA的缓冲液。对于与生物素系统一起使用或检测磷蛋白,不建议使用脱脂奶粉。

4.    抗体孵育

封闭后,将膜与第一抗体(结合靶蛋白)一起温育,然后与HRP-或AP-偶联的第二抗体一起温育。

  • 用TBS洗涤缓冲液稀释一抗; 遵循制造商的抗体方案进行最佳稀释。
  • 将第一抗体和膜在4℃孵育过夜或在室温下孵育1-2小时。为获得最佳结果,可能需要优化孵育时间和抗体浓度。
  • 用TBS洗涤缓冲液洗涤膜3X各10分钟以除去未结合的抗体。
  • 用TBS阻断缓冲液稀释二抗; 遵循制造商的抗体方案进行最佳稀释。
  • 将第二抗体和膜在4℃下孵育过夜或在室温下在摇床上孵育1-2小时。
  • 用TBS洗涤缓冲液洗涤膜3X各10分钟以除去未结合的抗体。

5.    信号检测

在本节中,我们提供了增强化学发光检测(ECL)和比色检测(DAB)方法的方案。使用符合您的偏好和标准的方法。

(A)增强化学发光检测(ECL)

  1. ECL基材制备
    • 根据初级抗体的种类选择正确的ECL试剂盒†。
一抗抗体的起源ECL套件目录号*
小鼠IgGEK1001
兔IgGEK1002
山羊IgGEK1003
大鼠IgGEK1004
小鼠IgMEK1005
  • *每个试剂盒都有足够的试剂用于800 cm2的膜。
  • †代替使用ECL试剂盒,其提供1)显色试剂A和B(浓缩20倍; 5mL),2)封闭缓冲液和3)HRP偶联的二抗,可以使用以下独立的显色试剂A和B之一:
试剂A.试剂B
产品浓。浓。目录 #
过敏ECL底物1X **100毫升1X **100毫升AR1170
过敏WB底物20X5毫升20X5毫升CR0001-5
过敏WB底物20X10毫升20X10毫升CR0001-10
过敏WB底物20X25毫升20X25毫升CR0001-25
  • ** 可以使用
  • 通过混合以下物质制备ECL底物溶液,并在制备后两小时内使用该溶液:
    – 50μL20X显色剂A(鲁米诺和亮度增强剂)
    – 50μL20X显色剂B(过氧化物酶和稳定剂)
    – 1 mL蒸馏水
  1. 膜处理
    • 用底物溶液彻底覆盖膜(使用1 mL溶液处理10 cm2膜)。
    • 在室温下孵育膜直至出现条带(通常1-5分钟;可以在暗室中估计孵育时间)。
    • 轻轻地将膜的边缘印在一张纸上以除去多余的任何底物溶液。
    • 在膜上放置透明的保鲜膜或透明玻璃纸,并去除所观察到的任何气泡。
  2. 电影发展与定位

使用我们推荐的WB开发和固定套件立即在暗室中开发和修复胶片; 或者,可以使用荧光CCD扫描,数字成像仪或发光计。

  • 将X光胶片放在膜上。
  • 通过将其浸入显影液中10分钟10分钟来开发胶片(确定在红光下观察所需的曝光时间,并在胶片达到实验目的后停止显影;对于最佳信噪比,可能需要多次曝光)。
  • 用清水冲洗薄膜(完全除去显影液),并在出现条带时停止清洗。
  • 将薄膜浸入固定溶液中3-5分钟。
  • 用清水洗涤薄膜以除去定影液。

笔记

  • 如果需要重复使用膜上的蛋白质,建议使用WB Stripping Buffer去除膜上的一抗和二抗。
  • 使用对照蛋白水平来标准化目标蛋白水平。

(B)比色检测

准备下面描述的DAB或BCIP / NBT底物溶液。

  1. DAB底物制备(用于HRP偶联的二抗)
    • 根据初级抗体的种类和理想的颜色选择正确的DAB试剂盒:
一抗抗体的起源颜色目录#DAB套件
小鼠IgG黄色SA2020
山羊IgG黄色SA2021
兔IgG黄色SA2022
大鼠IgG黄色SA2023
小鼠IgG蓝色SA2024
兔IgG蓝色SA2025
  • 通过混合以下物质制备DAB底物溶液:
    – 50μL40X显色试剂A(DAB)
    – 50μL40X显色试剂B(H2O2)
    – 50μL40X显色试剂C(TBS洗涤缓冲液)
    – 2 mL蒸馏水水
  1. BCIP / NBT底物制备(用于AP-缀合的二抗)
    • 通过混合以下物质制备BCIP / NBT底物溶液:
      – 50μL20X显色剂A(BCIP / NBT)
      – 50μL20X显色剂B(Tris浓缩缓冲液,pH 9.4)
      – 1 mL蒸馏水
  2. 膜处理
    • 用底物溶液彻底覆盖膜(使用1 mL溶液处理10 cm2膜)。
    • 在室温下孵育膜直至出现条带(通常10-30分钟); BCIP / NBT孵化应在黑暗中进行。
    • 用蒸馏水洗涤膜以停止反应。
    • 观察乐队并拍照。

免费咨询热线:400-080-3779

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