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Western Blot实验故障排除方法

Western Blot实验(蛋白质印迹)故障排除技巧

 

以下指南作为蛋白质印迹分析中一些最常遇到的问题的可能原因和解决方案的清单。

  1. 高背景

 

可能的原因
1抗体浓度太高优化和降低抗体浓度
2聚集二抗形成通过0.2μm过滤器过滤二抗
使用新的二抗
3抗体孵育温度太高将抗体在4°C孵育
4非特异性二抗结合或与阻断剂的交叉反应性运行二抗对照(无初级)
降低二级抗体浓度
一抗或二抗与阻断剂的交叉反应性将Tween-20加入孵育和洗涤缓冲液中
6不相容的阻断剂比较不同的阻塞缓冲区
7阻塞不完整优化封闭缓冲液的选择
增加封闭剂中的蛋白质浓度
优化封闭时间和/或温度; 在常温下
封闭2小时或在4℃下封闭过夜。将0.05%Tween 20去污剂加入封闭剂
中将0.05%Tween 20去污剂加入抗体稀释液中
8阻塞不足延长阻断时间或使用兼容的阻断剂(例如脱脂乳,BSA,血清等)
9抗体与其他蛋白质的交叉反应性使用不同的封闭剂(不要使用脱脂牛奶和生物素系统
降低二级抗体浓度
测试二级抗体和膜之间的交叉反应性
10洗涤不足增加洗涤次数和缓冲液量
将0.05%吐温20洗涤剂加入洗涤缓冲液中
11曝光时间太长减少曝光时间
12膜问题使用干净的镊子; 用手套操作
使用新膜
确保液体足以保持膜湿润
在孵化中使用脱色表
避免膜重叠
小心处理并避免损坏膜
13膜洗涤不充分增加洗涤次数
14不相容的膜硝酸纤维素膜的背景低于PVDF膜
15干膜确保膜上覆盖足够量的液体并防止其干燥
16受污染的缓冲区使用前请使用新的缓冲区或过滤缓冲区
17受污染的设备确保所有设备和工具清洁,膜上没有凝胶
  1. /无信号

 

可能的原因
1不正确的蛋白质转移到膜转移后的染色凝胶完成以确定转移是有效的
使用Ponceau S染色膜以确定转移是否有效
确保转移过程中凝胶和膜之间的充分接触
确保转移夹层正确组装
湿膜根据说明
避免电转移期间过热
使用阳性对照或分子量标记物
优化转移时间和电流
使用Boster的膜转移缓冲液(AR1149)处理时
避免样品(抗原决定簇)破坏
2蛋白质和膜结合不足向转移缓冲液中加入20%甲醇
使用小孔膜
3抗体不足增加抗体浓度
4抗原不足加载更多蛋白质
通过阻断缓冲液掩蔽抗原比较不同的阻断缓冲液
优化阻断剂的蛋白质浓度
减少阻断时间
6缓冲液中存在叠氮化钠从缓冲液中消除叠氮化钠
7曝光时间太短加长胶片曝光时间
8基质培养时间太短将底物孵育时间延长至五分钟
9在膜上消化蛋白质优化封闭剂的用量
10储存期间蛋白质的降解重新制备蛋白质样品
11不相容的一抗和二抗确保一抗,二抗,底物,酶系统和样品兼容
使用加载控制来测试第二检测系统的有效性
12低浓度的一抗和/或二抗增加抗体浓度
增加孵育时间
13阻断剂和抗体(一级或二级)之间的交叉反应使用温和的清洁剂,如Tween20
改变阻滞剂(常用的是牛奶,牛血清白蛋白,血清或明胶)
14一抗不能识别测试样品中的蛋白质检查说明
使用正控制
15目标蛋白含量低或无含量(无效抗原)使用阳性对照
增加每孔20-30μg蛋白质的加载量
使用蛋白酶抑制剂或分数提取物靶蛋白
16转移不足和过度洗涤使用Ponceau S
浸泡PVDF膜在甲醇中检查转移
避免过度洗涤
17过阻塞使用0.05%脱脂牛奶或不含牛奶稀释剂缓冲剂
更换封闭剂
减少封闭时间
18一抗有效性丧失准备新鲜抗体并在不使用时妥善储存
避免反复冻融
19叠氮化钠对二抗的抑制作用避免使用叠氮化钠和HRP-缀合的抗体
20酶结合物和底物的有效性丧失混合酶结合物和底物(酶无活性时无显色)
使用活化酶结合物和新鲜底物
21膜的湿转移不正确将PVDF膜浸泡在100%甲醇中
22靶蛋白分子量不足(<10 kDa)使用小口径膜
减少转移时间
23靶蛋白的等电点和转移缓冲液的pH值之间的值相等或接近尝试其他缓冲液,如CAPS缓冲液(pH 10.5)
尝试低pH值缓冲液,如醋酸缓冲液
24甲醇浓度太高降低甲醇浓度或使用异丙醇

 

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