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Western Blot样品制备指南

Western Blot样品制备方法

为了提取蛋白质用于蛋白质印迹分析,第一步是从样品中制备裂解物。细胞培养和组织是最常见的样本。

  1. 蛋白质提取
    1. 从细胞培养物中提取
      • 在细胞培养皿中培养细胞直至80%汇合。
      • 将培养皿置于冰上并在冰冷的PBS缓冲液(10mM Na 2 HPO 4和8mM Na 2 H 2 PO 4,含0.2%吐温20; pH7.4)中冲洗细胞。
      • 吸出PBS并加入冰冷的裂解缓冲液(150mM NaCl,1%NP-40,50mM Tris-HCl和蛋白酶抑制剂)。
      • 使用冷塑性细胞刮板或用05%胰蛋白酶细胞和PBS洗涤消化细胞将粘附细胞从培养皿上刮下。尽可能温和细胞,以避免诱导细胞应激途径。
      • 将细胞在3,000rpm,4℃下离心2-3分钟。
      • 除去上清液,用冰冷的PBS缓冲液洗涤2次。
      • 轻轻地将细胞沉淀物转移到冰冷的管中。
      • 将哺乳动物细胞蛋白质提取试剂(Boster目录号AR0103)加入管中(v / v:6/1:提取试剂/细胞沉淀)并剧烈重悬。
      • 如果上述溶液变暗,则将其超声处理10-15秒以分解蛋白质。
      • 将细胞在RIPA裂解物缓冲液中在冰上裂解4-5小时。
      • 如果细胞溶液仍然模糊,则再次进行超声处理和裂解。
      • 在~10,000 rpm和4°C下离心10分钟。离心力和时间可根据细胞类型而变化。
      • 通过将中间溶液等分到新管中并将管保持在-20℃来丢弃脂质(在顶部)和细胞碎片(在底部)。
    2. 从组织中提取
      • 将手术切除的组织置于预冷(4℃)生理盐水中。确保从组织中清洗掉任何血液。
      • 将组织切成小块(每块1克至1克)。
      • 添加广谱蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Boster Catalog#AR1182)。
      • 每1g组织加入10mL哺乳动物组织蛋白质提取试剂(Boster Catalog#AR0101)。
      • 将组织切碎并将切碎的组织放入组织匀浆器中。
      • 加入冰冷的裂解缓冲液(对于5mg组织片,加入300μL缓冲液。应根据存在的组织量确定缓冲液体积)。
      • 将组织匀浆在冰上裂解4-5小时或在4℃(高速)下裂解5分钟。
      • 如有必要,超声处理直至没有组织块残留。
      • 在~10,000 rpm和4°C下离心10分钟。离心力和时间可根据样品类型而变化。
      • 通过将中间溶液等分到新管中并将管保持在-20℃来丢弃脂质(在顶部)和细胞碎片(在底部)。
    3. 蛋白质定量分析

本文描述了我们的BCA(Bicinchoninic Acid)蛋白质分析试剂盒(Boster目录号AR0146)的试管方案。有关微孔板协议,请参阅我们的数据表。

  1. 试剂准备
    • 用9%NaCl或PBS重构白蛋白标准安瓿(BSA)以产生2000μg/ mL的工作溶液(管A)。
    • 将50 mL BCA试剂A与1 mL BCA试剂B(即稀释剂)充分混合。
    • 如下混合稀释剂和BSA,制备稀释的BSA标准品:
稀释剂体积(μL)BSA体积(μL)BSA浓度(μg/ mL)
一个0600(来自A管)2000
100300(来自A管)1500
C300300(来自A管)1000
d200200(来自B管)750
Ë300300(来自C管)500
F300300(来自E管)250
G300300(来自F管)125
H400100(来自G管)25
我(空白)30000
  1. 定量分析(对于试管方案,样品与工作范围的比率为1:20)。
    • 移取1mL每种标准品和未知样品,复制到适当标记的试管中。
    • 向每个管中加入0 mL工作范围(WR)并充分混合。
    • 用以下方案之一覆盖并孵育管:
      • 标准方案:37°C,30分钟(WR:25至2,000μg/ mL)。
      • RT方案:室温2小时(WR:25至2,000μg/ mL)。
      • 增强方案:60°C,30分钟(WR:5至250μg/ mL)。

注意:增加孵育时间和温度可以增加每次测试的净562 nm吸光度,并降低试剂的最低检测水平和方案的工作范围。使用水浴加热管,用于标准(37°C孵育)或增强(60°C孵育)方案。由于不均匀的传热,使用强制通风培养箱会在颜色发展中引入显着的误差。

  • 将所有管冷却至室温
  • 将分光光度计设置为562 nm,将仪器“零”置于仅用水填充的比色杯中。随后,在10分钟内测量所有样品的吸光度。

注意:由于BCA测定未达到真正的终点,即使冷却至室温后,显色仍将继续。然而,因为在室温下显色速率低,如果所有管的562nm吸光度测量值彼此在10分钟内进行,则不会引入显着误差。

  • 从所有其他单个标准和未知样品重复的562nm吸光度测量值中减去空白标准重复的平均562nm吸光度测量值。
  • 通过绘制每种BSA标准品的平均空白校正562 nm测量值与其浓度(μg/ mL)的关系,绘制标准曲线。使用标准曲线确定每个未知样品的蛋白质浓度。

免费咨询热线:400-080-3779

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