筛选重组克隆的5种方法

验证基因已成功克隆的方法

接近克隆工作流程完毕的时候。 将DNA片段连接到选择的载体中并转化到大肠杆菌细胞中。 将转化的细胞划过培养板,导致大量菌落过夜。 你怎么知道所有的步骤都导致了正确的重组克隆? 在您宣布克隆获胜之前,必须筛选殖民地以取得积极成果。 下面列出的是5种常用的方法。

1.蓝白色屏幕
蓝白筛选是一种广泛使用的技术,用于检查成功的克隆。在该方法中,将插入物克隆到含有编码α-半乳糖苷酶功能性亚基的lacZα序列的载体中。多克隆位点位于lacZα序列内。该质粒必须转化成具有lacZΔM15突变的特定大肠杆菌菌株。由于α-肽(β-半乳糖苷酶)的活性保持完整,空载体会产生蓝色菌落。筛选板中提供的无色X-gal(乳糖类似物)被β-半乳糖苷酶水解形成蓝色颜料(5,5'-二溴-4,4'-二氯 - 靛蓝)。如果载体含有破坏lacZα序列的DNA插入片段,则α肽不会被表达,X-gal也不会被水解。因此,如果存在DNA插入物,则菌落将是白色的。有可能获得假阳性(没有插入物的白色菌落),因此建议在白色菌落中进一步确认插入物。

2.正向选择向量
简化筛选的有效方法是使用正向选择向量。阳性选择载体有条件地表达致死基因,例如消化细菌宿主的基因组DNA的限制酶。通过将DNA插入片段连接到克隆位点来破坏致死基因的表达。结果,只有具有重组质粒的细胞才能生长。这种方法可以节省时间和成本,因为它通常会产生> 99%的重组克隆。 Thermo Scientific CloneJET PCR克隆试剂盒采用阳性克隆选择方法。

3.诊断限制摘要
还可以进行限制酶消化以确定正确的插入片段。首先,使用质粒小量制备试剂盒如Thermo Scientific GeneJET Plasmid Miniprep试剂盒从过夜细菌培养物中分离质粒DNA。我们的REsearch限制性位点映射工具可用于确定给定序列中的限制性位点。选择限制性内切酶,可以让您轻松确定质粒是否含有插入片段。然后,用限制性内切酶从重组克隆中消化纯化的质粒DNA。为了获得快速的结果,我们推荐Thermo Scientific™FastDigest™限制酶。在琼脂糖凝胶上运行消化的质粒以证实载体骨架和插入片段具有预期的大小。

4.菌落PCR
也可以通过使用PCR筛选细菌菌落来确定DNA插入物的存在。引物可以是插入特异性的,载体特异性的或两者以检测插入物。为了确定插入物的方向,推荐使用载体特异性和插入特异性引物的组合。通过PCR进行的菌落筛选适用于短于3kb的插入片段。使用Thermo Scientific™PCR试剂可以将单个菌落直接接入PCR主混合物。菌落的剩余部分可以用于接种培养平板或含适当抗生素的液体LB培养基用于下游应用。

5.排序验证重组菌落的最准确方法是通过测序。首先从过夜细菌培养物中分离质粒DNA。插入片段可以使用适合于载体的测序引物通过Sanger测序来鉴定。需要对整个插入片段进行测序以验证插入的确切顺序。

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