1. 组织准备
1. 多聚甲醛冷却和脱水
- 收获新鲜组织并将其放入装有冰冷PBS缓冲液的培养皿中
- 用PBS彻底清洗组织以去除血液（使用镊子去除结缔组织）
- 将组织切成厚度为3mm或更小的切片
- 将切片浸入室温下的4％多聚甲醛中8分钟
- 将切片浸入4％多聚甲醛（在4℃预冷却）中6至7小时。多聚甲醛体积应比组织体积重20倍
- 用PBS清洗组织3次（每次1分钟）
- 按如下方式浸泡组织，使组织脱水：
- 1倍至80％乙醇（4°C下1小时）
- 1倍至90％乙醇（4°C下1小时）
- 3倍于95％乙醇（4°C各1小时）
- 3倍于100％乙醇（4°C各1小时）
- 3倍于二甲苯（室温下各5小时）
2. 液体石蜡切片
- 在合适的浴液中制备第一部分液体石蜡，使石蜡达到并保持在60℃
- 将组织2X浸入石蜡浴（每次2小时）
- 在合适的浴中制备第二部分液体石蜡，使石蜡达到并保持在60℃
- 将第二部分石蜡倒入模具中
- 用石蜡快速将组织从石蜡浴输送到模具中
- 在室温下孵育组织直至其凝固
- 将组织储存在4°C
3. 剖面切片和孵化
- 将石蜡切片固定在切片机上
- 切成一到两块切片以调整切片机，使切片和刀片平行
- 用~5μm厚切片仔细切片剩余部分
- 将切片切片在40至50°C的水中孵育以展开
- 将组织切片安装到Poly-Lysine或APES涂层玻璃载玻片上
- 将载玻片在37℃孵育过夜
注意：使用多聚甲醛和福尔马林固定剂的这种固定程序可能会导致绿色光谱中的自发荧光。在这种情况下，如果您有红外检测系统，您可以尝试（i）红色范围或（ii）红外范围内的荧光团。
2. 脱蜡/脱蜡
- 准备以下试剂：
- 90％二甲苯
- 95％二甲苯
- 100％二甲苯
- 90％乙醇
- 95％乙醇
- 100％乙醇
- 按顺序将石蜡切片浸入：
- 90％二甲苯（7分钟）
- 95％二甲苯（7分钟）
- 100％二甲苯（7分钟）
- 90％乙醇（7分钟）
- 95％乙醇（7分钟）
- 100％乙醇（7分钟）
- 用水洗涤载玻片以除去乙醇
注意：脱蜡过程应在夏季室温下通风橱中进行。当温度低于18°C时，建议在50°C下脱蜡。
3. 失活
- 将脱蜡的石蜡切片在室温下浸入3％H 2 O 2中10分钟
- 用蒸馏水清洗3X至5X（总共3至5分钟）
4. 抗原检索（热诱导表位检索：HIER）
- 将石蜡切片浸入柠檬酸盐缓冲液中
- 用微波炉加热缓冲液，当缓冲液煮沸时将其关闭
- 将煮沸的缓冲液保持在微波炉中5至10分钟
- 如上所述重复加热1X至2X
- 冷却载玻片直至达到室温
- 用PBS洗涤1X至2X的切片
5. 闭塞
- 向HIER处理的样品中加入5％BSA封闭溶液或正常山羊血清
- 将样品在37°C孵育30分钟
- 丢弃额外的液体（不需要洗涤）
6. 一抗孵育
- 用抗体稀释剂稀释一抗至抗体制造商推荐的浓度
- 将稀释的抗体加入样品中，在4℃或37℃下孵育1小时
- 用PBS洗涤样品2次（每次20分钟）
7. 二抗孵育
- 用抗体稀释剂稀释生物素化的二抗至抗体制造商推荐的浓度
- 将稀释的抗体加入样品中并在37℃下孵育30分钟
- 用PBS洗涤样品2次（每次20分钟）
8. 染色
- 将Strept-Avidin生物素复合物（SABC）HRP-或AP-缀合的试剂添加到样品中
- 将样品在37°C孵育30分钟
- 用PBS洗涤样品3次（每次20分钟）
- 向样品中加入适量的DAB试剂，在室温下避光孵育10至30分钟
- 在明视野显微镜下监测组织染色强度*
- 用蒸馏水将样品洗涤3X至5X
- 反击（如有必要）
- 向样品中加入苏木精
- 脱水
- 将石蜡切片浸入二甲苯中2次（每次7分钟）
- 在明视野显微镜下检查组织染色强度
*如果染色背景太高，在SABC反应后和DAB染色前，用0.01-0.02％TWEEN 20 PBS清洗4X，用纯PBS清洗2X。然后使用DAB染色样品。
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