如何避免限制消化反应的7个常见问题

我们列出了七种常见的限制消化常见问题,并解释了如何确定并解决它们以帮助您改进结果。

问题1.由于酶失活,导致酶消化不完全或无法消化

由于限制酶可能由于储存或处理不当而失去活性,重要的是始终检查有效期,确认酶已储存在-20°C,并检查冷冻箱的温度(不允许温度超过-20°C,因为多次冻融循环(超过3次循环)可能导致酶活性降低)。

使用1μg标准对照DNA(例如λDNA)建立对照反应,测试酶的活性,其中您知道DNA质量高且具有预期的条带模式(图1)。

避免将酶储存在经受温度波动的无霜冻结器中。还建议将酶保持在冷藏室的冷藏架中,因为这有助于稳定储藏温度。

图1.用BamHI消化λDNA,0.7%琼脂糖,5个切割位点

问题2.由于反应条件不理想,不完全消化或不消化

如果消化对照DNA没有问题,那么您的反应可能会有其他问题。要评估适当的反应条件,请按照下列步骤操作:

1.确认您使用的是推荐的反应缓冲液,包括产品支持材料中指定的任何添加剂。
2.确保你使用分子生物学级别的水。
3.确保限制酶是添加到反应混合物中的最终组分,并且最终的甘油含量低于5%,使得酶体积小于总反应体积的十分之一。
4.仔细检查所用酶的最佳反应温度,并控制孵育过程中的蒸发,因为缓冲液中盐浓度的增加会抑制酶的性能。

如果反应参数都是正确的,请考虑模板DNA:

1.在最终的反应混合物中最佳的DNA浓度在20-100ng /μL之间。
2.DNA底物不应含有污染物或反应组分,如SDS,EDTA,蛋白质,盐和乙醇。

问题3.由于DNA甲基化阻断的酶活性,不完全消化或不消化

如果你的酶是活性的,消化对照DNA并且反应是使用最佳条件设定的,但你仍然看到消化问题,这可能是因为酶被模板DNA的甲基化所抑制。几种内源性甲基化酶位点特异性甲基化腺嘌呤(DAM)或胞嘧啶(DCM)残基并可影响酶活性(图2)。

例如,通过脱氧腺苷甲基化酶(DAM甲基化)的甲基化通常在GATC序列的大肠杆菌中发生。该序列与一些酶的识别位点重叠,如BamHI和BclI。在这种情况下,BamHI在存在或不存在甲基化的情况下切割DNA,而BclI不能切割甲基化的DNA。

为了克服这种限制,您可以将质粒DNA转化为dam-minus,dcm-minus菌株,如大肠杆菌 GM2163。这些甲基化阴性菌株不会干扰甲基化(图3)。

图2. BamHI和Bcll识别序列的甲基化位点。

图3.甲基化减菌株的基因型。

 

问题4.由于底物DNA的结构不完整或不消化

PCR片段:
PCR产物的不完全消化或不消化可能是由于识别位点接近DNA片段的末端。一些限制性内切酶需要额外的侧翼碱基来进行有效的DNA结合和切割(图4)。

由于识别位点通常在PCR片段和/或引物的末端被引入,因此了解需要多少碱基位点才能实现最佳切割是很重要的。

酶供应商通常提供表格,说明从识别位点末端应该存在多少碱基以获得最佳活性。

例如,即使识别位点位于片段的末端,PasI也可以切割DNA,而PaeI需要至少5个额外的碱基才能进行最佳消化(图5)。

图4.切割接近DNA模板末端的PCR产物。限制性位点通常位于PCR引物的5'末端。

图5. PaeI,PagI和PasI的相对切割效率作为其识别位点侧翼残基数量的函数。

质粒DNA:
如果您试图在多克隆位点使用两种酶进行双重消化,如果两个识别位点过于接近,则高效切割可能会很困难。一种酶可以物理阻断第二种酶进入其相应位点。无效裂解也与先前描述的识别位点接近DNA末端有关。一个酶切割后,可能没有足够的碱基位于第二个位点的第二个位点上,以便第二个酶结合并影响切割。

出于这些原因,如果可能的话,选择进一步分开进行克隆的限制性位点。但是,如果您必须使用距离很近的站点,请考虑按顺序进行消解。而且,在建立反应之前,确定哪种酶在切割接近DNA片段末端时更有效,然后使用该酶。

在这个例子中,XbaI和SalI在pUC19多克隆位点(MCS)中彼此相邻(图6)。如果你先用XbaI切割,SalI只能以高达20%的效率切割。

但是,如果您先用SalI切割,则XbaI可在切割线末端切割,效率高达100%。出于这个原因,您应该进行连续反应并用SalI消化,然后用XbaI来制备用于克隆的质粒(图7)。

图6. pUC19 MCS。

图7.切割效率有助于确定顺序消化的最佳顺序。

 

问题5.由于星形活动(脱靶切割)引起的意外解理模式

星形活性,也称为脱靶切割,是限制性内切酶的一种不希望的但内在的特性。酶特异性的丧失导致在与酶的规范识别位点相似但不相同的位点处发生切割。

在推荐条件下使用最佳缓冲液时,大多数酶不会表现出明星活性。然而,在不理想或极端条件下,恒星活动可能会发生。这些条件包括:

高甘油浓度(在最终反应中超过5%)。大多数商业酶与甘油一起配制用于稳定性并防止在-20℃下冻结。
高酶:DNA比例或过度消化
高pH或低离子强度
存在有机溶剂,如DMSO或乙醇
在反应混合物中使用镁以外的二价阳离子
包含其他非最佳缓冲条件
延长孵化期,如过夜消化
你如何减少消化反应中星形活动的可能性?

选择一个已经解决星型活性的酶供应商如下:
优化他们的酶和缓冲剂以减少星形活动,
提供具有低活性或无内在星形活性的异构体,和
提供工程或修饰酶来消除星形活动
按照每种酶提供的建议进行最佳活性,包括使用正确的缓冲液,酶的名称和酶的反应时间。
了解如何识别恒星活动,并将其与不完全消化和凝胶移位效应区分开来。
不完全消化导致凝胶上预期条带以上的附加条带。当孵育时间或酶量增加时,这些条带消失,如将泳道2和3中的样品与泳道4中完全消化的样品进行比较时所见(图8)。

如第5条和第6条所示,Star活动会在最小预期大小以下产生额外的乐队。随着酶剂量或时间的增加,这些条带通常会变得更强烈,而预期条带变得不那么强烈(图8)。

图8.不完整和完全消化和星状活动的条带模式。

问题6.由于凝胶移位效应引起的意外解理模式
凝胶移位是另一种酶属性的结果,并且在凝胶上观察消化的样品时可导致意想不到的条带模式。使用高酶剂量时通常更明显,并且对可视化样品可能具有较小或显着的影响(图9A)。

消化后通过热灭活酶,典型地通过在65℃或80℃温育10至20分钟,可以使凝胶移位效应最小化。这因酶而异,有些酶不能有效地热灭活。

第二种减少凝胶转移的方法是在加载到凝胶上之前将SDS加入上样缓冲液中。这些方法会使酶变性,从DNA片段中释放出来(图9B)。

图9.图A:凝胶移位效应。图B:上样缓冲液中的凝胶移位效应+/- SDS。

 

问题7.意外解理模式 - 其他

如果您在凝胶上看到意外的分裂模式,并且证实它不是来自不完全消化,星形活性或凝胶移位效应,还有更多可能的原因。

限制酶管或反应缓冲管可能被第二种酶污染。这可能发生在同一反应缓冲液用于多种不同的酶的情况下。测试此方法的唯一方法是尝试使用一管新的酶或反应缓冲液。
另一个原因可能是DNA底物的污染。通过使用新鲜的DNA制剂检查此。
在极少数情况下,底物DNA中可能存在意想不到的识别位点。您可以检查PCR扩增期间可能引入的突变。在连接DNA片段后,还有可能产生新的限制性位点。
最后,一些限制酶具有简并识别位点。例如,GTMKAC中的XmiI切割,其中M是A或C,K是G或T.确保检查所有潜在位点的底物序列。(图10)。

 

图10.一些限制性位点退化并可能导致意外的条带模式。

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