热启动技术如何为您的PCR带来益处?

非特异性扩增是可能严重影响PCR性能的主要问题之一,导致以下一种或多种结果:
  • 目标扩增子产量低
  • 目标扩增子的灵敏度下降
  • 结果差的解释
  • 下游应用效果不佳。

非特异性扩增的常见来源是由DNA聚合酶引起的错误引导靶标的延伸和引物二聚体的形成。研究人员用来避免非特异性扩增的一种解决方法是在冰上制备PCR反应混合物。降低的温度有助于保持DNA聚合酶的活性低,但是在PCR开始之前仍然可能发生不需要的产物的合成。另一种解决方案是使用热启动DNA聚合酶。热启动技术和相关修饰在室温下抑制DNA聚合酶活性,有效地防止假性非特异性扩增。?

热启动技术如何工作?

热启动PCR的方法使用酶修饰剂,例如抗体,亲和体或适体。最常用的两种方法是化学修饰和抗体。虽然它们都能抑制室温下的聚合酶活性,但两者之间存在一些关键差异。?

热启动技术优点缺点
化学聚合酶被化学修饰以阻断其在室温下的活性
  • 热启动修饰允许更严格的条件导致特异性增加
  • 无动物源组分
  • 需要较长的重新激活时间才能使聚合酶完全活化
  • 化学修饰可影响3kb或更多的扩增子长度的聚合酶性能
基于抗体的使用对聚合酶特异的抗体在室温下阻断聚合酶的活性
  • 抗体对聚合酶性能没有影响,因此所有的酶特征都是完整的,如非热启动酶
  • 高特异性
  • 作为PCR循环期间的初始变性步骤所需的额外时间不足以激活聚合酶
  • 抗体可以是动物来源的

热启动技术有什么好处?

  • 阻止引物与低同源性(引导错误)的模板序列结合。
  • 在PCR开始之前防止引物在反应设置期间彼此结合(引物 – 二聚体形成)。
  • 提高所需目标片段的灵敏度和产量。
  • 热启动聚合酶能够在室温下进行反应设置而不会牺牲特异性,使得更容易运行大量反应或使用自动液体处理平台进行PCR。

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