免疫组织化学的应用

免疫组织化学的应用

介绍

免疫组织化学(IHC)是通过利用与生物组织中的抗原特异性结合的抗体原理来检测组织切片细胞中的抗原或半抗原的方法。可以以不同方式显现抗体 – 抗原结合。诸如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的酶通常用于催化产生颜色的反应。

IHC广泛用于许多研究和临床实验室,因为该技术使得可以可视化细胞内和特定组织环境中特定细胞组分的分布和定位。有许多IHC方法可用于定位抗原。选择的方法应包括考虑参数,如样本类型和测定灵敏度。

在本文中,将涵盖以下主题:

  1. 样品制备
  2. 固定术
  3. 组织切片
  4. 石蜡包埋
  5. 失活和阻止
  6. 抗原检索
  7. 发现
  8. 染色体,反击物和载体介质
  1. 样品制备

    样品采集和制备在IHC中起重要作用,因为抗原展示和定位在很大程度上取决于组织样品的质量。

    1. 细胞样本

      1. 贴壁细胞
        • 细胞攀爬:在带有盖玻片,培养容器或腔室载玻片的多孔培养板上培养贴壁细胞
        • 直接细胞培养:直接在培养容器或多孔培养板上培养贴壁细胞
      2. 非贴壁细胞细胞涂片:用化学键粘附盖玻片上的非粘附细胞
        • 偏心细胞涂片:通过细胞微离心法在培养容器上粘附非粘附细胞
    2. 组织样本

      组织样本通常取自各种来源的样本:活组织检查,手术,动物模型和尸检。前三种标本给予新鲜组织,而最后一种(尸检)是在动物死亡两小时后进行的,这或多或少是死后自溶。由于抗原可能变性,消失和扩散,应尽快固定尸检标本,以免影响其标签。

      收集,固定和切片样品时要小心

      • 使用锋利的刀和剪刀,以避免挤压损坏
      • 刀具应平整,小而薄(正常尺寸为1.0厘米×1.0厘米×0.2厘米)
      • 消除脂肪组织和钙化区
      • 从活体动物收集样品并在洗涤后立即固定样品
      • 选择患病而不是坏死区域
      • 如有必要,选择正常组织作为对照
      • 切片后立即制作石蜡包埋的组织或冷冻组织,或将组织储存在-70℃的液氮容器或冰箱中
  2. 固定方法

    1. 目的

      • 保持细胞清晰和组织形状,以防止死后自溶,腐烂,内源性和外源酶活性
      • 通过将蛋白质,脂肪,糖和细胞酶转移到不溶性物质中来防止抗原扩散,从而保持细胞结构和位置
      • 在组织中沉淀和凝固材料以产生不同的折射
      • 诱导组织以增强玻璃载玻片的工作
      • 防止细胞萎缩和肿胀
      • 通过与着色剂的不同亲和力使颜色澄清组织
    2. 选择固定液

      以下是常用的修复解决方案列表。您可能需要测试特定类型的溶液是否适合您检测到的抗原,因为没有针对不同种类的抗原固定的标准固定溶液。

        1. 丙酮和酒精这两种类型的溶液是主要的固定溶液,起到促进糖和脂肪沉淀以及维持免疫能力的作用。
          • 酒精对维持低分子量蛋白质,多肽和细胞质蛋白质无效。但是,它可以与冰醋酸,乙醚,氯仿和甲醛混合。
          • 丙酮通常用于冷冻组织和细胞学涂片,因为它具有很强的渗透性和脱水性。
        2. 醛它是一种双功能交联剂,由于其强渗透性,低收缩性和低背景而被广泛使用。它有助于保持组织之间的交联并维持抗原。
          • 福尔马林(10%中性缓冲)是最广泛使用的
          • 4%多聚甲醛优于甲醛
          • Bouin的溶液(含有苦味酸)是组织学和病理学中应用最广泛的
          • Zamboni的解决方案应用于光学和电子显微镜免疫细胞化学,并且在超微结构组织维持方面优于甲醛
        3. 无醛
          • 碳二亚胺,二甲基乙酰胺,二甲基 – 亚磺酰亚胺,对苯醌广泛用于肽激素的组织固定。
          • 这些固定剂更好地与戊二醛或多聚甲醛混合。

      近年来,已有一种新型的无甲醛固定溶液可供使用。由于使用非蛋白质交联,强大的DNA / RNA保存,没有细胞液泡,组织收缩,该解决方案具有低毒性和可降解化学试剂,在IHC,常规病理检查和分子病理学检测中获得广泛普及。和pyknosis。

    3. 方法和时间

        1. 方法:浸入式浸泡方法将组织在固定溶液(在4℃,如果需要)中腌制一段特定的时间,该时间由抗原稳定性和所用固定溶液的类型决定。活组织检查和手术标本以及其他非灌洗组织通常采用这种固定方法。
        2. 方法:灌溉该方法具有完全和快速固定组织的能力,抑制内源性过氧化物酶的干扰。因此,它是动物实验中的一种选择方法。
        3. 固定时间固定时间取决于组织厚度,溶液浓度和实验温度。原则上,时间与组织厚度成正比,但与溶液浓度成反比。

      固定组织时要小心

        • 不要过度固定组织
        • 固定后保持组织新鲜
        • 使用足够的固定溶液,固定后将其彻底清洗干净
        • 使用尺寸小于2厘米×1.5厘米×0.3厘米(厚度<0.3厘米)的纸巾
  3. 组织切片

    1. 滑动预处理

      以下预处理程序旨在防止由高温,高压,辐射和其他因素引起的剥落。

      1. 微观幻灯片由于表面附着油,新的载玻片应浸入清洁液中12至24小时。将载玻片在蒸馏水中洗涤5次以上后,将其浸入95%乙醇中2小时,然后用简单的擦拭或在红外烘箱中干燥。注意避免在洗涤过程中刮伤滑块。注意:IHC的显微镜载玻片需要为5μm。然而,神经组织的滑动应该是20-100μm,以增强从不纤维方向的跟踪。
      2. 盖玻片盖玻片预处理程序与用于显微镜载玻片的程序非常相似,不同之处在于浸渍和清洁应在2小时内完成,因为盖玻片要薄得多。
      3. 组织切片安装
        • 用丙酮稀释3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APES)
        • 用APES涂覆显微镜载玻片
        • 在涂层载玻片上涂抹组织,然后在组织上加入一滴封固剂(甘油明胶)
        • 将盖玻片保持在45°,使液滴沿着滑动边缘扩散
        • 用盖玻片完全缓慢地覆盖组织
        • 如果组织切片存在粘连问题,将载玻片在80℃孵育1小时
    2. 组织切片类型

      1. 冻结的这类组织切片最重要的特征是完全保持抗原的免疫能力,尤其是细胞表面抗原。新鲜和固定的组织都可以作为冷冻组织加工。但是,组织必须干燥(或初级固定)并在低温下储存。
      2. 石蜡包埋通常用旋转切片机切片石蜡包埋的组织切片,得到2-7μm的厚度。通过适当的治疗,该部分显示清晰的组织结构和精确的抗原位置,以实现高医学价值病理学研究和回顾性研究。此款型号可在4℃下保存,可长期使用。
    3. 处理

      1. 盖片上的细胞
        • 将沉淀的盖玻片放入培养瓶或穿孔板中
        • 细胞生长达到60%后取出盖玻片
        • 用冷丙酮或4%多聚甲醛固定盖玻片10至30分钟
        • 在-20℃保存细胞(明胶)
      2. 细胞涂片
        • 收集非粘附细胞并用冷PBS缓冲液洗涤2次
        • 用PBS缓冲液重悬细胞
        • 向沉降的载玻片中加入30-50μL并均匀涂抹
        • 空气干燥滑动一点,用4%多聚甲醛覆盖细胞2-4小时
        • 在-20℃保存细胞(明胶)
  4. 石蜡包埋

    石蜡包埋涉及五个主要步骤:固定,脱水,透明化,浸泡和嵌入。

    1. 固定方法

      请参阅上述固定部分。

      1. 固定术请参阅上述固定部分。
      2. 脱水该步骤完全去除水,为下一步骤创造条件并使感兴趣的组织硬化。下面描述的脱水剂与水完全混溶,并且可以用水以不同的体积比制备。
        1. 乙醇作为最常用的脱水剂,乙醇具有很强的水分离和组织硬化能力。然而,由于乙醇具有强烈的渗透性和收缩性,因此其浓度应逐渐增加以避免组织过度收缩。
        2. 丙酮作为通常的酒精替代品,丙酮既可作为定影液,也可作为快速脱水剂。注意丙酮的脱水时间,因为它往往会使组织过硬。
      3. 透明化在脱水后,感兴趣的组织需要透明化步骤,因为在前一步骤中使用的脱水剂与来自后续步骤之一的石蜡不混溶。添加透明试剂有助于石蜡吸收到组织中。常见的透明试剂是:
        1. 二甲苯作为最广泛使用的透明试剂,二甲苯可与乙醇和丙酮混溶,并且它可作为石蜡的熔融剂。由于二甲苯对组织具有强烈且快速的收缩性,因此组织不应长时间浸入或者过于脆而且太硬。
        2. 苯和甲苯这些试剂类似于二甲苯。然而,它们对组织具有弱的和缓慢的收缩性,因此组织可以浸没在这些试剂中更长的时间。请注意,苯和甲苯具有高毒性,必须小心处理。
        3. 氯仿与二甲苯,苯和甲苯相比,氯仿是一种更温和的试剂。然而,它具有小的折射率,因此组织应该比其他透明试剂浸入氯仿中更长的时间,以保证完全渗透。
        4. 雪松油由于雪松油产生的最小硬化,它是适用于细和软组织的透明剂。超硬组织(例如皮肤组织)和致密纤维组织在浸入雪松油后也更容易切片。然而,这种油由于其高浓度和弱穿透性而对其他常见组织切片无用。

        近年来,市场上出现了一种新型的环保型透明剂。这种新试剂的主要成分是烷烃,而不是芳香族化合物,它可以用来代替二甲苯。

      4. 浸没透明化后,可将组织浸入熔融的石蜡中,使其吸附蜡替代透明剂。根据蜡的熔点,浸泡应在54-64℃下进行。
      5. 嵌入这是在石蜡盒中处理组织以使石蜡冷却并凝固的过程。处理条件(使用乙醇和二甲苯作为例子)显示在下表中。冷却完成后,组织将准备好切片并适合储存。
        试剂时间(小时)
        175%乙醇0.5到2
        285%乙醇0.5到2
        395%乙醇2
        495%乙醇2
        95%乙醇2
        6100%乙醇0.5比1
        7100%乙醇0.5比1
        8100%乙醇0.5比1
        9二甲苯0.25
        10二甲苯0.25
        11二甲苯0.25
        12石蜡0.5
        13石蜡1到2
        14石蜡1到2
    2. 组织切片类型

      1. 冻结的这类组织切片最重要的特征是完全保持抗原的免疫能力,尤其是细胞表面抗原。新鲜和固定的组织都可以作为冷冻组织加工。但是,组织必须干燥(或初级固定)并在低温下储存。
      2. 石蜡包埋通常用旋转切片机切片石蜡包埋的组织切片,得到2-7μm的厚度。通过适当的治疗,该部分显示清晰的组织结构和精确的抗原位置,以实现高医学价值病理学研究和回顾性研究。此款型号可在4℃下保存,可长期使用。
    3. 处理

      1. 盖片上的细胞
        • 将沉淀的盖玻片放入培养瓶或穿孔板中
        • 细胞生长达到60%后取出盖玻片
        • 用冷丙酮或4%多聚甲醛固定盖玻片10至30分钟
        • 在-20℃保存细胞(明胶)
      2. 细胞涂片
        • 收集非粘附细胞并用冷PBS缓冲液洗涤2次
        • 用PBS缓冲液重悬细胞
        • 向沉降的载玻片中加入30-50μL并均匀涂抹
        • 空气干燥滑动一点,用4%多聚甲醛覆盖细胞2-4小时
        • 在-20℃保存细胞(明胶)
  5. 失活和阻止

    1. 失活

      当辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)系统应用于IHC时,应阻断或抑制内源酶的活化以避免产生非特异性结合。

      1. 内源性HRP失活
        • 将石蜡包埋切片在3%H 2 O 2中孵育10分钟
        • 将冷冻切片或细胞切片在由甲醇和3%H2O2(v / v:4:1)组成的溶液中孵育30分钟
      2. 内源性AP失活
        • 将样品切片在0.1mM左旋咪唑中孵育
        • 注意:左旋咪唑不能抑制内源性肠组织的AP活化
      3. 闭塞组织切片上的残留位点可以与二抗结合并产生随后的假阳性结果。因此,来自与二抗相同物种的血清通常用于阻断。血清中的动物自身抗体可以提前与这些部位结合。堵塞应在室温下进行10-30分钟(避免过度堵塞)。
    2. 组织切片类型

      1. 冻结的这类组织切片最重要的特征是完全保持抗原的免疫能力,尤其是细胞表面抗原。新鲜和固定的组织都可以作为冷冻组织加工。但是,组织必须干燥(或初级固定)并在低温下储存。
      2. 石蜡包埋通常用旋转切片机切片石蜡包埋的组织切片,得到2-7μm的厚度。通过适当的治疗,该部分显示清晰的组织结构和精确的抗原位置,以实现高医学价值病理学研究和回顾性研究。此款型号可在4℃下保存,可长期使用。
    3. 处理

      1. 盖片上的细胞
        • 将沉淀的盖玻片放入培养瓶或穿孔板中
        • 细胞生长达到60%后取出盖玻片
        • 用冷丙酮或4%多聚甲醛固定盖玻片10至30分钟
        • 在-20℃保存细胞(明胶)
      2. 细胞涂片
        • 收集非粘附细胞并用冷PBS缓冲液洗涤2次
        • 用PBS缓冲液重悬细胞
        • 向沉降的载玻片中加入30-50μL并均匀涂抹
        • 空气干燥滑动一点,用4%多聚甲醛覆盖细胞2-4小时
        • 在-20℃保存细胞(明胶)
  6. 抗原检索

    甲醛固定通常产生亚甲基桥,其交联蛋白质并因此掩盖目标表位。必须通过加热(热诱导的表位检索:HIER)或酶消化(蛋白水解诱导的表位检索:PIER)来揭示抗原表位以允许抗体结合。

    1. HIER

      HIER方法可以通过微波,高压或水浴来实现。它破坏亚甲基桥并暴露表位以允许抗体通过连续加热而结合。需要以下抗原修复试剂:

      • 0.01 M柠檬酸盐缓冲溶液(pH 6.0)
      • 0.01 M PBS缓冲液(pH7.0)
      • 0.05 M EDTA(pH 8.0)
      • 0.05 M Tris-EDTA(pH 9.0)
      • 0.05 M Tris-HCl(pH 1~12)
      1. 微波法
        • 将样品部分放入可微波处理的容器中,其中存在抗原修复试剂
        • 将容器放入微波炉中
        • 将微波辐射应用于样品5-20分钟
      2. 高压法
        • 将样品切片放入适当的容器中,其中存在抗原修复试剂
        • 将容器放入高压锅内
        • 打开电磁炉,加热样品直至沸腾
        • 煮沸开始后,在样品达到全压1-4分钟后关闭炊具
      3. 水浴法
        • 将样品切片放入适当的容器中,其中存在抗原修复试剂
        • 将容器和温度计放入水浴室内
        • 将样品加热至室温92℃
        • 将样品在92℃加热20-40分钟后取出样品

      笔记

      • 应适当控制上述抗原修复方法的温度和时间。
      • 为避免原始蛋白质结构恢复,请不要将样品部分从缓冲溶液中取出来冷却。
      • 温度越高,加热时间越短(反之亦然)。
    2. 码头

      表位可以通过与蛋白酶一起孵育来暴露,所述蛋白酶可以破坏亚甲基桥。消化酶的选择取决于抗原成分。胃蛋白酶和菠萝蛋白酶用于检索细胞间质中的抗原。其他酶可用于细胞内抗原暴露。

      工作集中消化条件
      胰蛋白酶0.05%至0.1%37℃(10至40分钟)*
      蛋白酶K.20μg/ mL37℃(20分钟)
      胃蛋白酶0.40%37℃(30至180分钟)

      *对于某些磨损的组织,可以增加反应时间。应制备新鲜的胰蛋白酶溶液,pH值调节至7.6,并在37℃下使用。

      1. 冻结的这类组织切片最重要的特征是完全保持抗原的免疫能力,尤其是细胞表面抗原。新鲜和固定的组织都可以作为冷冻组织加工。但是,组织必须干燥(或初级固定)并在低温下储存。
      2. 石蜡包埋通常用旋转切片机切片石蜡包埋的组织切片,得到2-7μm的厚度。通过适当的治疗,该部分显示清晰的组织结构和精确的抗原位置,以实现高医学价值病理学研究和回顾性研究。此款型号可在4℃下保存,可长期使用。
  7. 发现

    IHC检测方法各不相同,并且基于分析报告和结合化学的性质以及其他因素。这里描述了三种方法:免疫荧光(IF),酶和亲和力。

    1. 免疫荧光法

      Coons和同事于1941年开发了IF技术。该技术用于通过将抗原暴露于已知的荧光染料标记抗体(即荧光染料)来快速鉴定抗原,荧光染料在被激光激发时产生光(例如氩) – 激光)。特异性抗体结合可以通过产生特征性可见光来确定,并通过荧光显微镜检测。表1和2分别显示了核染色和IF的一些常见荧光染料及其相应的激发(λex)和发射波长(λem)。

      表1:用于核染色的常见荧光染料

      荧光λex(nm)λem(nm)颜色
      AO405530→640淡黄色(绿色→橙色)
      DAPI358461蓝色
      EB488610
      PI488620
      赫斯特33258352461蓝色
      赫斯特33342352461蓝色

      Coons和同事于1941年开发了IF技术。该技术用于通过将抗原暴露于已知的荧光染料标记抗体(即荧光染料)来快速鉴定抗原,荧光染料在被激光激发时产生光(例如氩) – 激光)。特异性抗体结合可以通过产生特征性可见光来确定,并通过荧光显微镜检测。表1和2分别显示了核染色和IF的一些常见荧光染料及其相应的激发(λex)和发射波长(λem)。

      表2:用于IF标记的常用荧光染料

      荧光λex(nm)λem(nm)颜色
      Alexa 488488497至643绿色
      Alexa 546五百四十五分之五百三十○六百七十五分之六百一十
      Alexa 647650668
      APC650660
      B-PE546,565575橙红色
      的Cy3554570
      FITC495525绿色
      RB200570596橙子
      R-PE480,546,565578橙红色
      德州红596620
      TRITC552570
      1. 原理间接染色过程包括三个步骤
        • 一抗特异性结合靶抗原
        • 用荧光团标记的二抗与一抗结合
        • 通过显微镜检测荧光团
      2. 协议
        • 将样品粘贴在载玻片上(为确保荧光染色的有效性,应进行阳性,阴性和样品自发荧光对照以确认没有非特异性结合。)
        • 加入适当稀释的一抗以覆盖样品
        • 将载玻片放入湿盒中,37℃孵育1-2小时
        • 用0.01M PBS(pH7.4)洗涤载玻片3X各5分钟
        • 去除样品上多余的水分(但保持湿润)
        • 用适当稀释的二抗覆盖样品
        • 将载玻片放入湿盒中,37℃孵育30-60分钟
        • 用0.01M PBS(pH7.4)洗涤载玻片3X各5分钟
        • 去除样品上多余的水分(但保持湿润)
        • 将缓冲的甘油(封固剂)添加到样品中并用盖玻片安装
        • 在荧光显微镜下观察盖玻片
      3. 提示:荧光显微镜的操作
        • 根据手册操作显微镜
        • 在使用前打开水银灯5-15分钟以稳定光源
        • 调节光源时戴防护眼镜,避免对眼睛产生有害的紫外线
        • 如果灯泡使用时间超过90分钟,高压汞灯的强度会下降(通常,灯泡连续使用1-2小时)
        • 如果样品被高压汞灯照射超过3分钟,则会发生光漂白(注意:样品通常在荧光染色后一小时内观察到)
        • 由于光源有限,请密集观察样品以节省时间
        • 关闭光源30分钟或更长时间后重新启动光源
        • 在一天内避免多次使用光源
        • 染色后立即观察样品
        • 荧光强度有四个级别:
          – :非自然荧光或弱自发荧光
          +:清晰可见的荧光
          ++:明亮可见的荧光
          +++:耀眼的可见荧光
      4. 复染和染色样品储存
        1. Nucleus Countertaining荧光染色后,应进行复染,使细胞和组织的形态结构明确,更容易看到特异性荧光。一些复染荧光染料是:
          • DAPI:经典的蓝色复染剂,广泛用于细胞核和染色体染色(DAPI选择性结合dsDNA而不在细胞质中进行背景染色; DAPI对活细胞具有半渗透性,可用于染色固定细胞和/或组织切片)
          • Hoechst 33342:用于对抗黄色荧光的初级复染剂
          • 碘化丙啶:初级复染剂,用于细胞核染色和黄色/红色荧光染色
        2. 染色样品储存染色后,应观察样品并立即在荧光显微镜下成像。如果不立即拍摄图像,应将它们安装在缓冲的甘油培养基中,并在4℃下储存不到一周。如果将抗荧光衰变介质应用于样品,荧光信号可能在一个月内不会显着衰减。
    2. 酶法

      酶促IHC技术由Nakane和Pierce在1967年引入。它通过利用抗体与抗原特异性结合的原理鉴定感兴趣的抗原。酶标记物与底物反应,得到可以分析的强烈着色的产物。酶技术的开发与IF技术的原理相似,但两者不同,因为酶用于标记酶法的抗体。酶IHC优于IF IHC的优点是:

      • 不需要荧光显微镜
      • 通过更好的对比度实现准确的抗原定位
      • 染色样品可以存放很长时间
      • 苏木精可用作复染剂,其增强组织形态学的研究
      • 通过光学显微镜(以及由于高电子密度的电子显微镜)可以容易地识别和观察最终产品颜色
      • 可以实施双重和多重污渍
      1. 标记酶抗体对于该方法,用于抗原检测的抗体在反应前已用酶标记。在与靶抗原反应后,标记的抗原形成抗原 – 抗体复合物,其中酶催化底物产生不溶的有色产物。随后,可以通过光学显微镜或电子显微镜分析产物。标记酶方法可以通过直接或间接检测完成。
        1. 直接检测直接方法是一步染色方法,其涉及直接与目标抗原反应的标记抗体(例如HRP-缀合的抗体)。然后使抗原 – 抗体-HRP复合物与DAB底物反应进行染色。虽然直接方法简单,快速且高度特异,但它具有低灵敏度和有限范围的直接标记的一抗。尽管存在缺点,但直接方法通常用于在大规模制造过程之前筛选单克隆抗体。
        2. 间接检测间接方法是两步法,其涉及与样品中的靶抗原结合的未标记的第一抗体(第一层)和与第一抗体反应的酶标记的第二抗体(第二层)。必须针对已经产生一抗的动物物种的IgG产生二抗。例如,如果第一抗体是兔抗人IgG,则酶标记的第二抗体可以是山羊抗兔IgG。与直接检测相比,间接检测具有许多优点。首先,对于间接方法,仅需要产生相对少量的标准缀合(标记)二抗。例如,针对兔IgG产生的标记的第二抗体可以“现成”购买,可用于在兔中产生的任何一抗。使用直接方法,有必要为每种感兴趣的抗原标记每种一抗。其次,间接方法具有更高的检测灵敏度。第三,可以设计各种控制并应用间接检测。
        3. 未标记的酶抗体
          1. 酶桥法TE Mason及其同事在1969年的出版物中描述了这种方法,该方法基于酶标记与靶抗原的结合,通过免疫球蛋白酶桥的抗原 – 抗体反应,其由以下组分组成:
            • 组织抗原(AnTAn)的特异性抗血清
            • 针对AnTAn的抗免疫球蛋白的抗血清
            • 针对与AnTAn相同物种中的酶标记制备的特异性抗血清
            • 酶标签
          2. 过氧化物酶 – 抗过氧化物酶(PAP)方法该方法包括用HRP部分免疫兔/山羊/大鼠抗体以产生抗HRP兔/山羊/大鼠抗体,然后该抗体与另一个HRP部分结合形成稳定的多边形。PAP方法由于其高灵敏度和低组织染色背景而优异。
      2. 协议
        • 将样品粘贴在载玻片上(为确保荧光染色的有效性,应进行阳性,阴性和样品自发荧光对照以确认没有非特异性结合。)
        • 加入适当稀释的一抗以覆盖样品
        • 将载玻片放入湿盒中,37℃孵育1-2小时
        • 用0.01M PBS(pH7.4)洗涤载玻片3X各5分钟
        • 去除样品上多余的水分(但保持湿润)
        • 用适当稀释的二抗覆盖样品
        • 将载玻片放入湿盒中,37℃孵育30-60分钟
        • 用0.01M PBS(pH7.4)洗涤载玻片3X各5分钟
        • 去除样品上多余的水分(但保持湿润)
        • 将缓冲的甘油(封固剂)添加到样品中并用盖玻片安装
        • 在荧光显微镜下观察盖玻片
      3. 提示:荧光显微镜的操作
        • 根据手册操作显微镜
        • 在使用前打开水银灯5-15分钟以稳定光源
        • 调节光源时戴防护眼镜,避免对眼睛产生有害的紫外线
        • 如果灯泡使用时间超过90分钟,高压汞灯的强度会下降(通常,灯泡连续使用1-2小时)
        • 如果样品被高压汞灯照射超过3分钟,则会发生光漂白(注意:样品通常在荧光染色后一小时内观察到)
        • 由于光源有限,请密集观察样品以节省时间
        • 关闭光源30分钟或更长时间后重新启动光源
        • 在一天内避免多次使用光源
        • 染色后立即观察样品
        • 荧光强度有四个级别:
          – :非自然荧光或弱自发荧光
          +:清晰可见的荧光
          ++:明亮可见的荧光
          +++:耀眼的可见荧光
      4. 复染和染色样品储存
        1. Nucleus Countertaining荧光染色后,应进行复染,使细胞和组织的形态结构明确,更容易看到特异性荧光。一些复染荧光染料是:
          • DAPI:经典的蓝色复染剂,广泛用于细胞核和染色体染色(DAPI选择性结合dsDNA而不在细胞质中进行背景染色; DAPI对活细胞具有半渗透性,可用于染色固定细胞和/或组织切片)
          • Hoechst 33342:用于对抗黄色荧光的初级复染剂
          • 碘化丙啶:初级复染剂,用于细胞核染色和黄色/红色荧光染色
        2. 染色样品储存染色后,应观察样品并立即在荧光显微镜下成像。如果不立即拍摄图像,应将它们安装在缓冲的甘油培养基中,并在4℃下储存不到一周。如果将抗荧光衰变介质应用于样品,荧光信号可能在一个月内不会显着衰减。
    3. 亲和方法

      通过使用更多数量的与组织结合的酶分子,可以提高IHC灵敏度。在这方面,抗生物素蛋白和生物素化抗体之间的多个结合位点已被用于IHC信号放大。蛋白质蛋白Avidin有四个低分子量维生素生物素结合位点,形成一个大的格子状复合物。除抗生物素蛋白外,还有其它涉及链霉抗生物素蛋白的方法,链霉抗生物素蛋白是从抗生物链霉菌(Streptomyces avidinii)中分离的四聚体生物素结合蛋白。抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白方法几乎完全相同,因为它们的结构非常相似(它们具有非常小的氨基酸同源性)。抗生物素蛋白 – 生物素过氧化物酶复合物(ABC)和标记的链霉抗生物素蛋白结合(LSB)是两种最广泛使用的用于扩增靶抗原信号的亲和方法。

      1. ABC该方法涉及四个连续步骤
        • 一抗与组织样品一起孵育以允许与靶抗原结合
        • 将生物素化的第二抗体(其具有针对第一抗体的特异性)与组织样品一起孵育以允许与第一抗体结合
        • 将生物素化酶(HRP或AP)与游离抗生物素蛋白预孵育以形成大的ABC复合物(生物素化酶和抗生物素蛋白以预定比例混合在一起以防止抗生物素蛋白饱和)
        • 将上述预孵育的溶液孵育到组织样品中
      2. LSB该方法使用酶标记的链霉抗生物素蛋白来检测组织切片上结合的生物素化的一抗。如果ABC方法中的复合物对于组织穿透来说太大,也可以应用它。由于其较小的尺寸,酶标记的链霉抗生物素蛋白用于使组织穿透。可以采用LSB方法代替ABC方法,以获得前者提高灵敏度和进一步降低信号的能力。以下信息描述了一般染色程序。
        • 一抗与组织样品一起孵育以允许与靶抗原结合
        • 将生物素化的第二抗体(其具有针对第一抗体的特异性)与组织样品一起孵育以允许与第一抗体结合
        • 将链霉抗生物素蛋白 – 酶缀合物孵育到组织样品中
  8. 染色体,反击物和载体介质

    1. 用于HRP的色原

      1. 轻拍DAB(3,3′-二氨基联苯胺)通常与基于HRP的免疫染色系统一起用作信号增强剂。来自DAB的深棕色终产物不溶于水和醇,稳定且适于长期储存。此外,可以在光学显微镜下观察终产物或用OsO4处理终产物用于在电子显微镜下观察。苏木精,甲基绿和甲基蓝是相容的复染剂。由于DAB可能导致皮肤和膀胱癌,因此建议使用个人防护设备,并避免皮肤/粘膜。
      2. AEC用AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)染色后,组织切片上的阳性区域变为暗红色。源自AEC的终产物可溶于有机溶剂,不能长期储存。与DAB类似,苏木精,甲基绿和甲基蓝是AEC的一些合适的抗原。应使用甘油明胶作为AEC封固剂。
    2. AP的色原体

      1. BCIP / NBT结合使用,BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基 – 磷酸酯)/ NBT(硝基蓝四唑鎓)是广泛接受的基于AP的免疫染色系统中使用的生色底物。暴露于AP后,基材变为蓝紫色或黑紫色。来自BCIP / NBT的终产物不溶于醇。核快红和亮绿是BCIP / NBT的合适复数。
      2. 快红TR盐Fast Red也用于AP的比色检测。其最终产品呈玫瑰色,可溶于酒精。这些反向染料用于快速红色色原体:甲基绿,亮绿和可溶性苏木精。
    3. 复染法

      在通过IHC染色靶抗原后,通常应用二次染色以提供对比度,其有助于初级染色更明显。虽然许多这些染色显示对离散抗原或细胞区室的特异性,但其他染色将提供整个细胞的染色。一些最常见的反量词描述如下:

      1. 苏木苏木精是一种从木材树的心材中提取的天然染料,用于细胞核染色。分化是指使用试剂(例如1%盐酸HCl和醇)去除由样品组织上的过度染色或非特异性染色引起的颜色的过程。在进行核仁染色(在铝苏木精中)和分化(在HCl和醇中)后,将组织切片从酸溶液转移到碱性溶液(例如氨水和磷酸氢二钠溶液)。在此过程中,该部分将从红棕色变为蓝色。这个过程被称为蓝色。苏木精亚分为Mayer’s苏木精和Harris苏木精。
        1. Mayer的苏木精是红紫色,具有几个特性:染色时间短,没有感知和金属膜,也没有染色后的分化。
        2. Harris苏木精是紫红色,广泛用于H&E染色,具有以下优点:染色快,色泽鲜艳,核仁染色清晰,组织形态清晰。虽然金属氧化物可能在长时间后漂浮在Harris苏木精溶液上,但在使用前不需要过滤,因为不会出现感知。用Harris苏木精染色后应进行分化和上蓝。
      2. 甲基绿甲基绿由金属绿色微晶或亮绿色粉末组成。溶于水后变成蓝绿色。这种碱性染料可以很容易地与高度聚合的DNA结合,并将细胞核变为绿色。用甲基绿对抗需要2到5分钟,然后洗涤样品,脱水和安装。
      3. 核快红在将组织切片应用2至5分钟后,该复染剂将核变为红色。
    4. 安装介质

      可以使用安装介质来附接盖玻片,或者可以将其自身用于替换盖玻片。通常,培养基的选择取决于几个因素,包括与色原体和复染剂的化学相容性以及保存期。

      1. 中性安装介质它通常是指pH7.0的油性物质,如中性胶(树脂)。安装前,样品应用二甲苯处理,透明和脱水,以便长期储存。
      2. 水溶性安装介质这种封固剂通常用于短期储存部分的IF染色,通常由50%甘油组成。

      下表总结了不同酶,色原和反染色体中封固剂的选择。

      显色染液安装介质
      HRP轻拍苏木精,甲基绿,甲基蓝中性
      HRPAEC苏木精,甲基蓝水溶性
      美联社BCIP / NBT核快红,亮绿中性
      美联社快红苏木精,甲基绿,亮绿水溶性
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