分子克隆

分子克隆技术原理,分子克隆基本步骤有哪些

分子克隆技术

长期以来,分子生物学一直是理解生物学中心教条中每个步骤的基础:DNA复制,DNA转录成RNA,以及RNA翻译成蛋白质。这些分子负责根据每个确切时刻的环境条件向每个生物体的细胞提供关于如何存活和繁殖的信息。所有这些信息都存储在细胞的遗传物质中,并转移到后代。

这种遗传物质的操作和研究是通过各种技术完成的,包括传统的分子克隆(文库构建),聚合酶链式反应(PCR),qRT-PCR等等。这些分子生物学技术在我们的科学界有广泛而有用的应用,包括:

  • 用于疾病诊断,医学治疗和基因治疗的分子医学
  • 生成新的蛋白质产品和药物疗法
  • 操纵生物体以获得所需的表型特征
  • 了解细胞的作用和生理学

分子克隆基础(图书馆建设)

分子克隆是用于研究蛋白质功能和结构的最基本的分子生物学技术之一。通常,在该技术中,使用PCR和/或限制酶将编码目的蛋白质的DNA克隆到质粒中。所有工程质粒或表达载体都有3个主要特征:

  1. 复制的起源
  2. 多克隆站点(MCS)或多克隆站点
  3. 选择标记(通常是抗生素抗性)

在野外,可以通过裸DNA的摄取,通过细胞 – 细胞接触的缀合或通过病毒载体的转导,将某种质粒导入原核细胞。另一方面,质粒也可以人工插入原核和真核细胞,如真菌和植物细胞或复合动物细胞。将DNA引入细胞可以通过物理或化学方法实现,并称为转化。一些可用的转化技术包括电穿孔,显微注射,磷酸钙转染和脂质体转染。可以产生稳定的转化,其中质粒整合到基因组中。或者如果质粒保持独立于基因组,我们就有所谓的瞬时转染。对于瞬时转染,

在更稳定的转化中,转染的基因可以插入细胞的基因组中,这保证了其在细胞后代中的复制。通常,标记基因与目的基因共转化,这为转化细胞提供了一些可选择的优势,例如抗生素抗性。一些转化细胞将(通过随机机会)整合外来遗传物质。当抗生素添加到细胞培养物中时,只有那些具有整合标记基因的细胞能够存活和增殖,而其他细胞会死亡。这是筛选的过程。施加这种选择性应激后,随着时间的推移,只有具有稳定转染的细胞存活并且可以选择。用于选择稳定转染的常用药剂的一些实例包括:氨苄青霉素,卡那霉素,Zeocin,嘌呤霉素,杀稻瘟素S,

现在可以使用插入的DNA中编码的遗传信息由细胞表达目的蛋白质。有多种系统可供选择,以帮助高水平表达这种蛋白质。然后可以在不同情况下测试该蛋白质的酶活性,在制药工业中研究,和/或蛋白质可以结晶以研究其三级结构。分子生物学的可能性是无穷无尽的!

DNA文库技术是当前分子生物学的基本技术,这些文库的应用范围取决于原始DNA片段的来源。分子克隆技术使科学家能够在合适的微生物中创建和储存来自不同来源的一组DNA片段,并利用细胞机制来保护和复制这些外源DNA片段。在分子生物学中,这种程序被称为DNA文库构建,我们可以存储不同种类的遗传物质,包括:cDNA(由逆转录RNA形成),由基因组DNA形成的基因组文库,等位基因突变体,线粒体DNA,随机突变体图书馆等……

通常将要储存的DNA片段插入克隆载体或质粒中,待使用的载体类型取决于用作生物文库的宿主微生物。例如,如果选择的微生物是如大肠杆菌的细菌,则预期使用BAC载体(细菌人工染色体载体)。而如果是酵母如酿酒酵母选择存储DNA片段,然后使用YAC载体(酵母人工载体)。宿主细胞机器将负责根据所用载体中包含的信息维持和复制外源DNA片段。将构建细菌或酵母群,使得每个生物平均含有一种构建体(载体+插入物)。随着种群在培养中生长,其中包含的DNA分子被“克隆”(复制和繁殖)。

 

可用于DNA文库的载体列表:

向量属性尺寸(kb
BAC

(细菌人工染色体)

细菌F因子和复制起点75 – 300
YAC

(酵母人工染色体)

酵母着丝粒和端粒100 – 1000
苹果电脑

(哺乳动物人工染色体)

哺乳动物着丝粒和端粒以及复制起点100 – > 1000
质粒多拷贝质粒<10
噬菌体噬菌体Υ5-10
粘粒噬菌体Υcos位点35-35

cDNA文库

本节介绍了cDNA文库构建的典型实验装置和基本原理。cDNA文库使用mRNA作为信息来源,因此它仅包括来自特定来源的生物体表达的基因。该mRNA可以从生物体的细胞,特定组织或甚至整个生物体中提取。mRNA需要通过逆转录酶转化为cDNA,以使宿主生物体能够进行mRNA的正确复制和转录过程。这意味着它代表了在提取和纯化mRNA时存在的确切条件(生理,环境和发育)下在该特定来源中活跃转录的基因。cDNA文库可用于反向遗传学,

选择mRNA作为DNA文库制备来源的主要优点是避免来自基因组DNA的垃圾DNA和来自真核基因的内含子。这确保了仅存储来自特定细胞或组织的表达基因。尽管细菌细胞不处理内含子,但使用成熟mRNA(已经剪接)允许cDNA基因在细菌宿主细胞中成功表达以进行进一步的生理学测试。

DNA库的常见应用是:

  • 鉴定新基因
  • 基因的体外功能表征
  • 转录组学分析
  • 根据选择性剪接鉴定基因版本

cDNA文库用于在原核生物中表达真核基因,因为它不包括内含子,因此可以在原核细胞中表达。cDNA文库从文库中除去大量非编码区,并且它也可用于随后分离编码该mRNA的基因。

 

基因组文库

基因组文库是克隆的集合,它们一起代表来自目标生物的总基因组DNA。将DNA储存在相同载体的群体中,每个载体含有不同的DNA插入物。构成基因组文库的克隆数量取决于:

  1. 生物体基因组的大小
  2. 特定克隆载体系统允许的插入大小

基因组DNA的组织来源通常并不重要,因为每个细胞含有相同的DNA(少数例外)。为了构建特定生物的基因组文库,应考虑几个变量,例如:宿主生物,载体类型,细胞转录和翻译机制等。但是,最基本的标准是使用宿主原核生物如果要收集的基因组来自原核生物,如果基因组是从真核生物中提取(应该存储在真核宿主中),则采用相同的原理。该选择标准对于增加成功的异源蛋白质表达的机会并允许进一步的生理学测试是至关重要的。该程序允许我们通过将其插入具有不同片段大小的特定载体中来存储特定生物的整个基因组,这取决于所用的限制酶。然后将携带小片基因组的载体转化到宿主生物细胞中用于进一步的实验室分析。

  1. 提取并纯化DNA
  2. 用限制酶消化DNA以将DNA切割成特定大小的片段,每个片段含有一个或多个基因
  3. 使用DNA连接酶,将DNA片段插入用相同限制酶切割的载体中。酶DNA连接酶将DNA片段退火或密封到载体中。这产生了大量重组分子,其通过转化被宿主细菌吸收,产生DNA文库。

 

例如,来自土壤的原核生物通常被靶向用于基因组文库程序,主要是因为它们具有抗几种抗生素的能力。这些生物的体外培养相当困难,这损害了生理学测试以鉴定参与抗生素抗性的基因。

应遵循DNA库构建的典型流程图协议(如前图所示)。首先从土壤生物中提取基因组,消化基因组,插入合适的载体,并在原核生物(例如大肠杆菌)中转化。然后,将大肠杆菌转化体接种在含有特定抗生素如卡那霉素的LB培养基中。只有携带来自土壤生物的基因的大肠杆菌转化体以及抗生素抗性标记才能生长。应选择阳性菌落对载体进行测序,并鉴定在抗生素抗性中起作用的基因。

南博屹生物提供分子克隆与质粒构建服务,详情电询400-080-3779

 

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