细胞转染方法、转染技术及转染技术应用

什么是转染?

转染是将核酸化学或机械地引入真核细胞的过程。

有几类转染技术 – 一些方法使用化学物质转染细胞,而另一些则基于机械原理。化学转染可以通过胞吞作用,脂质体介导的进入(称为脂质转染)或化合物与细胞表面标志物的相互作用发生。机械转染通常通过称为电穿孔的过程中的电流发生。将核酸递送到细胞中的其他方法包括病毒递送(通常称为转导)和转化 – 使用质粒将DNA递送到细胞中。在所有情况下,该过程涉及增加受体细胞膜的渗透性以允许外源遗传物质进入细胞质。根据有效载荷的设计和目的地,交付的货物可以保留在细胞质中或继续进入细胞核(如果细胞有一个)。在细胞质中,核酸可用于多种目的; 基因可以通过细胞机器表达,特定序列可以用于mRNA的转录调节,蛋白质可以改变细胞内过程。在细胞核中,基因可以整合到基因组DNA中,从而确保它们通过细胞稳定表达。

转染对科学和医学研究至关重要。该方法已被广泛用于开发从艾滋病到癌症的疾病的基因疗法,并且它在我们寻求理解细胞过程中是必不可少的。通过转染修饰转基因生物,因此该技术在科学界和市场中具有广泛的适用性。转基因小鼠模型用于测试新药,而转基因宠物越来越受欢迎。无论何种应用,转染都已成为生物学进步的强大而多功能的工具。

DNA通常是转染的目标。修饰细胞的基因组永久地导致稳定的转染,
而所需蛋白质的选择性表达导致瞬时转染。

瞬时转染与稳定转染

核酸的转染可以用于多种目标。在大多数情况下,进行转染以限制蛋白质表达或引起由转染的核酸编码的蛋白质的表达。在这两种情况下,转染的技术方面都会对最终结果产生重大影响。可以将转染的核酸引入细胞并翻译(称为瞬时转染),或者可以将其掺入细胞的基因组中(称为稳定转染)。下面列出了这两种类型的详细信息:

 

 

瞬时转染:

  • 转染的DNA进入细胞但不整合到细胞的基因组中
  • 宿主细胞翻译转染的分子,导致靶蛋白表达的大量增加
  • 由于缺乏整合,转染的分子仅在被细胞降解之前被利用,典型的效果仅持续数天
  • 瞬时转染也适用于不整合到细胞基因组中但仍可影响基因表达的siRNA和miRNA
  • 可以通过化学和电穿孔技术进行瞬时转染

稳定转染:

黄金大米是维生素A缺乏人群营养的显着改善,是一种稳定转化的大米。普通水稻(左图)有两个转染的基因,它们负责β-胡萝卜素的生物合成,β-胡萝卜素是维生素A的前体。

  • 少量转染的DNA颗粒整合到细胞基因组中
  • 外来DNA的整合是不可预测的,通常很少见
  • 线性DNA插入通常比使用超螺旋DNA更成功
  • shRNA质粒DNA可以整合到基因组DNA中,以便转录为miRNA或siRNA; RNA分子不能稳定地整合到基因组中
  • 通常使用病毒或显微注射方法
  • 存在非特异性整合到细胞基因组中的固有风险
  • 通常,所需基因与报告基因偶联(例如对抗生素的抗性),以允许在转染后消除不含所需基因的细胞。

与瞬时转染相比,稳定转染更难实现。然而,为了在基因疗法中实现长期基因表达,进行额外的努力以产生稳定转染的细胞系。然后可以培养这些永久性修饰的细胞,允许更大规模的蛋白质生产或需要这种细胞的特定遗传研究。

表达大于正常量的所需蛋白质的稳定细胞系是关键的实验室工具,其发挥作用,例如产生治疗性蛋白质(包括重组抗体),作为遗传研究的对象,并且是用于筛选实验药物的测试环境。传统上,重组蛋白由稳定转染的哺乳动物细胞产生。转染和细胞培养生长悬浮方法的最新改进增加了研究人员从瞬时转染的细胞产生蛋白质的能力。新技术也有助于公众健康,因为目前的胰岛素生产主要来自稳定转染的细菌。

许多研究已将转染的细胞系用于各种目的。以下列表包括对转染领域有重要贡献的研究结果,并证明了转染技术的广泛适用性:

  • 用脂质转染试剂转染产蛋白质的DNA
    • 研究人员使用阳离子脂质转染试剂研究H​​EK293和CHO细胞的瞬时转染。两种类型的细胞都产生可接受的绿色荧光蛋白(GFP)滴度和分泌的IgG抗体。该研究还评估了受试细胞中促红细胞生成素和因子IX的产生。
  • 制造高滴度无辅助逆转录病毒
    • 研究人员在293T细胞中使用瞬时转染来表达逆转录病毒包装功能。瞬时转染避免了在72小时内找到稳定表达的克隆并产生高滴度的逆转录病毒的耗时过程。
  • 通过激光转染
    • 使用飞秒细胞膜的飞秒,高强度,近红外激光脉冲成功转染细胞。该方法被证明具有高效率,并且左转染的细胞基本上完整。
  • 阳离子聚合物转染
    • 研究人员使用阳离子聚合物转染HEK293细胞(悬浮生长)。阳离子聚合物(分支的和线性的)在转染中是成功的并且是可扩展的。得到的蛋白质以显着的水平产生,没有典型的,不希望的生产性质,例如先前使用聚合转染试剂所见的中等调节作用。

南博屹生物提供转染服务

转染技术

毛孔原理图
由于施加的电压,细胞膜变得可渗透。
形成膜的脂质分子重排以允许电势在膜上均衡。
这反过来允许核酸通过膜中形成的“孔”进入细胞。

电穿孔是转染细胞的常用技术。它包括向细胞施加电场,这允许细胞膜接受带电的DNA颗粒进入细胞。电穿孔比化学转染更有效,特别是在通常难以转染的细胞中,但该方法毒性更大,需要小心处理细胞和特殊的愈合缓冲液。电穿孔的成功取决于各种因素,包括电场强度和施加电压的持续时间。尽管有一些挫折,但电穿孔在进行转染实验方面非常成功,并且通用性足以用于大多数细胞类型。

脂质体

脂质体是由与组成细胞膜的聚合物类似的聚合物制成的小的膜结合胶囊。当配制成含有DNA时,脂质转染试剂与细胞膜融合并将其货物释放到细胞中。这通常被称为“脂质转染”。基于脂质的转染试剂利用细胞膜的半透性特征将外来核酸分子运输到细胞中。脂质 – 核酸复合物通常通过胞吞作用克服细胞膜,之后核酸释放到细胞质中。

化学转染

化学转染可以以多种方式完成。最便宜的方法之一是磷酸钙沉淀,其中含有DNA货物的氯化钙溶液与磷酸盐离子的HEPES-盐水缓冲液混合,导致不溶性磷酸钙沉淀并使DNA结合在沉淀物表面上。然后将沉淀物(悬浮液中)与细胞混合,沉淀物被细胞吸收,包括DNA载体。

另一种方法包括使用树枝状聚合物,树枝状聚合物是高度支化的有机化合物,其结合DNA并将其递送到细胞中。该方法依赖于使用能够使货物通过细胞膜的标记物。

其他转染方法

存在许多不太常见的转染方法,包括以下方法:

  • Sonoporation:高强度声音可用于使细胞膜可渗透,从而允许进行转染。
  • 细胞挤压:使用微流体装置温和挤压细胞可诱导转染。
  • Impalefection:将与其表面结合的DNA的纳米纤维物理插入细胞中。
  • 光学转染:高焦点激光在单个细胞的细胞膜上产生临时开口,使DNA能够穿透细胞。
  • 原生质体融合:用溶菌酶处理细胞以除去细胞壁,然后第二种融合技术(使用聚合物或电穿孔)将原生质体与外源DNA融合到细胞中。
  • 磁力作用:使用磁场将磁性纳米颗粒与DNA结合进入靶细胞。
  • 基因枪(粒子轰击):DNA与生物相容的固体纳米粒子偶联并“射入”靶细胞的细胞核。

细胞与分子生物学研究

方法,协议和实验室技术

微生物和生物化学研究技术的标准方案。涵盖的技术包括用于炎症,癌症和其他药物研究的异种移植,以及通过RNAi效应的基因沉默,例如siRNA和shRNA。还存在特异于基因表达,细胞信号传导,转染,蛋白质产生,纳米颗粒在生物学研究中的用途以及用于治疗用途的RNAi物种的递送的技术。这个特定的门户网站专注于分子和细胞生物学研究方法,实验方案和实验室技术,如:

  • 基因沉默和RNA干扰(RNAi)
  • 干细胞和  癌细胞系
  • 体外  蛋白质表达
  • 细胞银行
  • 质粒DNA克隆
  • 体内  转染试剂盒
  • 纳米粒子
  • 瞬态和稳定的转染
  • mRNA表达和qRT-PCR
  • siRNA / shRNA / microRNA转染表达
  • 抗体生产
  • 脂质体包裹
  • 开发稳定的细胞系
  • 电穿孔和DNA融合
  • 体内  siRNA转染
  • 合同实验室服务(CRO)
  • 基于细胞的分析开发
  • 异种移植动物模型服务

转染应用

研究领域
转基因玉米是通过转染实现的。将来自Bt细菌的基因导入玉米中以产生杀虫剂。

转染导致了一些惊人的发展; 从转基因生物到蛋白质生产,转染已广泛应用于科学和医学领域。研究人员通过转染进入细胞基因组的能力已经导致细菌应用于人类需求的空前飞跃。由于细胞被修饰并生长以产生胰岛素,胰岛素生产一度罕见且昂贵。发光鱼虽然不一定对人类进步至关重要,但已经向娱乐和动物产业展示了转染的深远应用。对鱼类和奶牛进行了遗传改良,以提高产量和可持续性。虽然驯化和选择在历史上具有重要意义,转染为我们提供了超越环境管理可能的生产能力。因此,消费者和工业都受益于转染技术的进步。

生物修复应用

转染对与废物处理和管理相关的方法产生了重大影响。在环境污染期间,生活在污染区域的细菌会自然消化有害化合物。然而,这一过程可能是漫长而低效的,特别是从基因编辑技术的进步的角度来看。因此,许多公司正在寻求使用转染技术为特定种类的环境污染创造有效的细菌。遗传修饰某些油脂降解菌株可以提高生物强化的整体效率,这种做法有助于提高我们应对石油泄漏等大规模环境污染事件的能力。

基因工程不是处理环境污染的唯一方法。生物修复服务还可以包括培养局部细菌和选择最佳菌株进行废物管理(参见  从土壤样品中分离煤油降解细菌和确定最佳生长条件)。一些公司提供生物修复服务,可针对特定污染物和环境进行优化。

未来发展

值得注意的是,转染不是由任何一个过程定义的。由于其在细胞上的最终结果,即细胞过程的功能修饰,该技术具有广泛的适用性。虽然目前  在体外已经在很大程度上开发了技术,在诸如人类的生物体中真核细胞的有效转染仍未得到解决。基因治疗在很大程度上受限于缺乏有效的遗传修饰细胞的过程。因此,转染技术的当前发展针对可能的方法,通过该方法可以在较大的生物体中实现稳定的转染。尽管如此,FDA已经批准了2017年12月首次对人类进行基因治疗的进展。特定疗法使用病毒传递机制,为缺陷细胞提供一系列DNA,用于产生对人类视觉至关重要的蛋白质。虽然只有一种这样的批准基因疗法,但未来转染技术的进步可能会导致更广泛的基因编辑技术的应用。

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