IHC固定优化
为您的样品选择最佳固定剂
固定可防止切除组织的自溶和坏死，保持其形态和抗原性以及增加其对加工的抵抗力。固定剂的选择至关重要，因为不同的固定剂对某些抗原比其他固定剂更优化。
| 抗原 | 最佳固定剂 |
| 低分子量肽和酶，小分子和氨基酸。 | 4％多聚甲醛 |
| 大型或精细组织，减数分裂染色体 | 布恩的固定剂 |
| 大蛋白质，核/区室化蛋白质 | 丙酮或甲醇 |
选择正确的固定方法
选择固定剂后，下一步就是将其应用于您的样品。有两种固定组织的方法：浸泡和灌注。浸泡是最常用的方法，适用于细胞培养和切除的组织样品。浸入式固定的理想时间取决于固定组织的大小和类型：较大，较密的样本需要比小的轻样本长得多。固定不足会导致边缘染色，而过度固定会使表位难以解除遮盖。通过阅读涉及与您的组织类型相似的IHC的论文来优化您的沉浸时间。
虽然浸泡固定通常适用于小组织碎片，但如果您必须分析来自同一动物的较大组织或多个组织样本，则需要灌注。通过血管系统的灌注可以快速且均匀地固定动物中的所有组织，但需要通过用4％多聚甲醛溶液替换动物的血液来牺牲动物。
IHC嵌入优化
石蜡包埋与冷冻组织
使用适当的方法和固定剂固定组织样本后，即可进行切片和安装。为了在切片期间保持组织形态，组织必须嵌入石蜡中。如果您在冰冻切片上进行IHC，则在切片后进行固定。使用冷冻或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品的决定取决于您打算使用哪些下游应用。
| Praffin嵌入式 | 冻结的 | |
| 固定步骤 | 预嵌入 | 后切片 |
| 切片设备 | 切片机 | 低温恒温器 |
| Stroage稳定性 | 多年的室温 | 一年-20℃ |
| 优点 | 组织形态保存 | 酶活性保存 |
| 缺点 | 导致更多的表位掩蔽 | 冰晶可能形成并破坏组织结构 |
| 下游应用 | DNA / RNA PCR扩增 | 用于FISH或细胞周期分析的游离核 |
| Preacautions | 必须监测温度以避免在脱蜡和安装之前熔化蜡。 | 组织必须冷冻并缓慢加热，以避免冰晶和破碎。 |
表位检索优化：HIER vs PIER
选择正确的抗原检索方法
用多聚甲醛固定组织样品的过程导致肽交联的形成，其用于保持组织结构和蛋白质定位。这些肽交联还可以掩蔽表位，使得抗体结合不可接近。为了获得高质量的IHC染色，必须在称为表位修复的过程中打破这些交联。
表位修复有两种常用方法：热诱导表位修复（HIER）和蛋白水解诱导表位修复（PIER）。选择正确的方法对于为您的应用程序获得最佳结果至关重要。
HIER是最常用的方法。它涉及在抗原修复溶液如柠檬酸盐或EDTA缓冲液存在下烘烤或微波加热组织切片。使用HIER时，缓冲区的选择很重要。pH值为6的柠檬酸盐在pH9时倾向于比EDTA更保守地解除表位。虽然EDTA可以导致更完整的表位暴露，但它也可以增加背景信号。使用连续切片测试哪种溶液可以获得最佳结果，并使用适当的对照检查非特异性染色。
PIER最常用蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶进行。PIER比HIER更具侵略性，并且可以破坏微妙的形态或抗原特征。这种侵蚀性使其不适合精细样品，但非常适合过度固定，干燥或顽固的样品。对于大多数样品类型，通常不建议使用PIER，因为通常不需要蛋白质降解的强度来有效地揭示抗原。