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免疫组织化学(IHC、免疫组化)实验优化技巧

IHC固定优化

为您的样品选择最佳固定剂

固定可防止切除组织的自溶和坏死,保持其形态和抗原性以及增加其对加工的抵抗力。固定剂的选择至关重要,因为不同的固定剂对某些抗原比其他固定剂更优化。

抗原最佳固定剂
低分子量肽和酶,小分子和氨基酸。4%多聚甲醛
大型或精细组织,减数分裂染色体布恩的固定剂
大蛋白质,核/区室化蛋白质丙酮或甲醇

选择正确的固定方法

选择固定剂后,下一步就是将其应用于您的样品。有两种固定组织的方法:浸泡和灌注。浸泡是最常用的方法,适用于细胞培养和切除的组织样品。浸入式固定的理想时间取决于固定组织的大小和类型:较大,较密的样本需要比小的轻样本长得多。固定不足会导致边缘染色,而过度固定会使表位难以解除遮盖。通过阅读涉及与您的组织类型相似的IHC的论文来优化您的沉浸时间。

虽然浸泡固定通常适用于小组织碎片,但如果您必须分析来自同一动物的较大组织或多个组织样本,则需要灌注。通过血管系统的灌注可以快速且均匀地固定动物中的所有组织,但需要通过用4%多聚甲醛溶液替换动物的血液来牺牲动物。

IHC嵌入优化

石蜡包埋与冷冻组织

使用适当的方法和固定剂固定组织样本后,即可进行切片和安装。为了在切片期间保持组织形态,组织必须嵌入石蜡中。如果您在冰冻切片上进行IHC,则在切片后进行固定。使用冷冻或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品的决定取决于您打算使用哪些下游应用。

Praffin嵌入式冻结的
固定步骤预嵌入后切片
切片设备切片机低温恒温器
Stroage稳定性多年的室温一年-20℃
优点组织形态保存酶活性保存
缺点导致更多的表位掩蔽冰晶可能形成并破坏组织结构
下游应用DNA / RNA PCR扩增用于FISH或细胞周期分析的游离核
Preacautions必须监测温度以避免在脱蜡和安装之前熔化蜡。组织必须冷冻并缓慢加热,以避免冰晶和破碎。

表位检索优化:HIER vs PIER

选择正确的抗原检索方法

用多聚甲醛固定组织样品的过程导致肽交联的形成,其用于保持组织结构和蛋白质定位。这些肽交联还可以掩蔽表位,使得抗体结合不可接近。为了获得高质量的IHC染色,必须在称为表位修复的过程中打破这些交联。

表位修复有两种常用方法:热诱导表位修复(HIER)和蛋白水解诱导表位修复(PIER)。选择正确的方法对于为您的应用程序获得最佳结果至关重要。

HIER是最常用的方法。它涉及在抗原修复溶液如柠檬酸盐或EDTA缓冲液存在下烘烤或微波加热组织切片。使用HIER时,缓冲区的选择很重要。pH值为6的柠檬酸盐在pH9时倾向于比EDTA更保守地解除表位。虽然EDTA可以导致更完整的表位暴露,但它也可以增加背景信号。使用连续切片测试哪种溶液可以获得最佳结果,并使用适当的对照检查非特异性染色。

PIER最常用蛋白酶K,胰蛋白酶或胃蛋白酶进行。PIER比HIER更具侵略性,并且可以破坏微妙的形态或抗原特征。这种侵蚀性使其不适合精细样品,但非常适合过度固定,干燥或顽固的样品。对于大多数样品类型,通常不建议使用PIER,因为通常不需要蛋白质降解的强度来有效地揭示抗原。

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