组织准备
- Snap Freezing和OCT嵌入
- 收获新鲜组织并将其放入装有冰冷PBS缓冲液的培养皿中
- 用PBS彻底清洗组织以去除血液（使用镊子去除结缔组织）
- 将组织切成厚度为3mm或更小的切片
- 立即快速冷冻在干冰中冷却的异戊烷中的组织，并将组织保持在-70°C（切割前不要让冷冻组织解冻）
- 在低温恒温切片之前，将组织定位在模具中（可以通过使用锡箔简单地制作）并在最佳切割温度（OCT）包埋介质中完全覆盖组织
- 使用镊子将模具底部置于液氮中1至2分钟（OCT应变为白色）
- 低温恒温器切片
- 将切片机盒和检测器分别预冷至-22°C和-24°C（确保刀片的完整性和光滑度）
- 将组织从模具放置到固定组织的检测器
- 快速仔细地将低温恒温器切片切成5-10μm，并将其安装在明胶涂层的组织切片上。注意：
- 使用盖玻片取出切片组织
- 低温恒温器温度应在-15°C至-23°C之间
- 如果样品太冷，这些部分会卷曲
- 如果样品太热，这些部分会粘到刀上
- 在室温下将切片空气干燥30分钟，以防止它们在抗体孵育期间从载玻片上掉落
- 将载玻片保存在-70°C。注意：
- 载玻片可在-70°C下未固定存放数月
- 保存用于以后分析的冷冻组织样品应完整保存
- 从冰箱中取出后，立即向每个组织切片中加入50μL冰冷的固定缓冲液
- 将冷冻切片浸入2-8°C的4％多聚甲醛中8分钟（或最佳在-20°C下保持20分钟）
- 用PBS洗涤3X部分并使其在室温下干燥30分钟
注意：使用多聚甲醛和福尔马林固定剂的这种固定程序可能会导致绿色光谱中的自发荧光。在这种情况下，如果您有红外检测系统，您可以尝试（i）红色范围或（ii）红外范围内的荧光团。
失活
- 将H2O2与蒸馏水混合（v / v：1：50）
- 将冷冻切片或细胞爬升切片浸入室温下稀释的H2O2中10分钟
- 洗3X蒸馏水（每次1分钟）
抗原检索（蛋白水解诱导的表位检索：PIER）
- 用滤纸擦干冰冻的部分
- 将化合物消化溶液（例如胰蛋白酶溶液或其他酶抗原修复溶液）添加到切片或切片中
- 在室温下孵育切片3至5分钟
- 用3X PBS洗涤切片（每次5分钟）
闭塞
- 向PIER处理的样品中加入5％BSA封闭溶液或正常山羊血清
- 将样品在37°C孵育30分钟
- 丢弃额外的液体（不需要洗涤）
一抗孵育
- 用抗体稀释剂稀释一抗至抗体制造商推荐的浓度
- 将稀释的抗体加入样品中并在37℃下孵育30分钟
- 用PBS洗涤样品2次（每次20分钟）
二抗孵育
- 用抗体稀释剂稀释生物素化的二抗，抗体制造商推荐的浓度
- 将稀释的抗体加入样品中并在37℃下孵育30分钟
- 用PBS洗涤样品2次（每次20分钟）
染色
- 将Strept-Avidin生物素复合物（SABC）HRP-或AP-缀合的试剂添加到样品中
- 将样品在37°C孵育30分钟
- 用PBS洗涤样品3次（每次20分钟）
- 向样品中加入适量的DAB试剂，在室温下避光孵育10至30分钟
- 在明视野显微镜下监测组织染色强度*
- 用蒸馏水将样品洗涤3X至5X
- 反击（如有必要）
- 向样品中加入苏木精
- 脱水
- 将石蜡切片浸入二甲苯中2次（每次7分钟）
- 在明视野显微镜下检查组织染色强度
*如果染色背景太高，在SABC反应后和DAB染色前，用0.01-0.02％TWEEN 20 PBS清洗4X，用纯PBS清洗2X。然后使用DAB染色样品。
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