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ICC /免疫荧光实验方案工作流程总结

1. 细胞攀爬切片准备

  • 将沉淀的盖玻片放入培养瓶或穿孔板中
  • 细胞生长达到60%后取出盖玻片
  • 用PBS洗涤盖玻片3X以除去培养基
  • 将盖玻片(细胞面朝上)浸入冷丙酮或4%多聚甲醛或中性福尔马林中10至20分钟(关闭盖子以防止蒸发)
  • 用PBS清洗盖玻片3X
  • 将盖玻片放在滤纸上(细胞朝上)
  • 取下盖玻片上的液体,让其干燥8-10小时
  • 为了解冻切片,在室温下用中性PBS洗涤10-15分钟(细胞爬升切片可以在-20℃下在明胶中储存一周。)

注意:使用多聚甲醛和福尔马林固定剂的这种固定程序可能会导致绿色光谱中的自发荧光。在这种情况下,如果您有红外检测系统,您可以尝试(i)红色范围或(ii)红外范围内的荧光团。

2. 失活

  • 将H2O2与蒸馏水混合(v / v:1:50)
  • 将冷冻切片或细胞爬升切片浸入室温下稀释的H2O2中10分钟
  • 洗3X蒸馏水(每次1分钟)

3. 抗原检索(蛋白水解诱导的表位检索:PIER)

  • 用滤纸擦干细胞切片
  • 将化合物消化溶液(例如胰蛋白酶溶液或其他酶抗原修复溶液)添加到切片中(我们建议在消化前向样品中添加1%Triton。这样可以降低表面张力并使试剂可以轻松覆盖整个样品。)
  • 将切片在室温下孵育10分钟
  • 用3X PBS洗涤(每次10分钟)

4. 闭塞

  • 向PIER处理的样品中加入5%BSA封闭溶液或正常山羊血清
  • 将样品在37°C孵育30分钟
  • 抖掉多余的液体并用滤纸擦干样品(不需要洗涤)

5. 一抗孵育

  • 用抗体稀释剂稀释一抗至抗体制造商推荐的浓度
  • 将稀释的抗体(推荐浓度:4μg至2μg)加入样品中并在4℃下孵育过夜
  • 用PBS洗涤样品3次(每次15分钟)

6. 二抗孵育

  • 用抗体稀释剂稀释生物素化的二抗至抗体制造商推荐的浓度
  • 将稀释的抗体加入样品中并在37℃下孵育30分钟
  • 用PBS洗涤样品3次(每次8分钟)

7. 染色

  • 添加Strept-Avidin生物素复合物 – 荧光异硫氰酸酯(SABC-FITC)或Strept-Avidin生物素复合物 – Cyanine-3(SABC-Cy3)试剂
  • 将样品在37°C孵育30分钟(避光)
  • 用PBS洗涤样品2次(共2小时)
  • 用水溶性密封剂密封切片
  • 在荧光显微镜下监测染色强度
  • 通过向样品中加入DAPI染色溶液来对抗
  • 在荧光显微镜下再次检查染色强度
  • 对于没有荧光信号显着衰减的载玻片存储,在样品中加入20μL抗褪色溶液,然后盖上盖玻片(避免气泡)

 

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