分子生物学常见问题及解答

 

  1. 完成DNA / RNA提取方案需要多长时间?

这取决于您打算使用的样品数量。通常对于5-10个样品,60分钟足以执行整个方案。在开始之前,请确保准备好所有试剂和溶液。

 

  1. 我应该使用什么裂解方法从我的样品中获取DNA / RNA

应该使用的裂解方法取决于细胞的膜和细胞壁特性。如果细胞没有细胞壁,则只能使用裂解缓冲液。虽然如果细胞有细胞壁,我们强烈建议使用酶或机械过程分别破坏细胞壁和细胞壁,如裂解酶或细胞壁。

 

  1. DNA / RNA提取方案中预期的浓度范围是多少?

DNA浓度取决于细胞样品中含有的DNA / RNA的量。通常从典型的DNA / RNA提取方案获得1-5μg。

 

  1. 是否有可能从少量细胞样本中提取DNA / RNA

是的。但是,您应该预计DNA浓度低于1微克DNA。

 

  1. 我可以从固体样品中提取DNA / RNA吗?

当您使用生物样本进行DNA / RNA提取时,您应该在提取方案中添加上一步。通常,建议使用液氮将固体样品破碎成小体积,以便在添加重悬浮缓冲液后获得细胞悬浮液。

 

  1. DNA / RNA的质量标准是什么?

检查Nanodrop中的DNA / RNA纯度时,对于RNA和DNA,您应该分别获得2.1和1.8的A260 / 280比率。A260 / 230比率应接近2且绝不低于1.8。

 

  1. 我可以存储DNA / RNA多长时间?

根据您的储存条件,您可以在4°C下立即使用,或在-20°C下储存1-2个月。

 

  1. 是否有可能使用具有不同Tm的引物对不同基因进行PCR反应?

有可能的。您只需使用热循环仪的温度梯度设置,并将PCR管放置在正确的温度行或列中,具体取决于热循环仪的功能。

 

  1. 我应该使用相同的聚合酶进行任何PCR吗?

可获得大量商业聚合酶,每种聚合酶具有不同的性质和应用。您应该考虑PCR反应的主要目标。

 

  1. 我可以使用PCR产物进行分子克隆吗?

PCR的一个应用是产生显着量的特定DNA片段以进行分子克隆。但是,建议在使用PCR产物前进行PCR纯化。PCR试剂可以抑制分子克隆中使用的一些酶。

 

  1. 是否需要在PCR之前始终进行DNA提取?

在某些情况下,您不需要进行DNA提取,这是菌落PCR的情况。通常,菌落PCR用于检查样品中是否存在特定片段而不进行DNA提取,通常在分子克隆后进行。该方法使用先前暴露于微波的完整细胞(其使细胞膜更具渗透性),然后添加PCR试剂。

 

  1. 我可以使用PCR产生侧翼为限制性位点的片段吗?

如果您将PCR产物用于分子克隆,您可以选择您想要使用的限制酶,然后将正向和反向引物添加到每个限制性位点的序列中。

 

  1. 如何在定点突变中使用PCR

定点诱变方法遵循标准PCR的所有原理,不同之处在于:引物组应包含待产生的核苷酸突变; 聚合酶应该是高保真聚合酶,以避免其他突变。

 

  1. 应该选择哪种管家基因

选择在所有测试条件下保持相同表达水平的管家基因至关重要。建议选择一个以上的管家基因并进行初步测试,以验证在测试的实验条件下表达水平是否相同。通常,这些是最常用的管家基因:18SGAPDHACTB然而,已经表明,在一些样品和条件下,甚至这些基因具有不同的表达模式。

 

  1. qRT-PCR中使用的重复数是多少?

选择的实验系统将定义要使用的重复数。至少,始终建议对每个样品执行3次重复。

 

  1. qRT-PCR的灵敏度范围是多少?

qRT-PCR的灵敏度高度依赖于所用的热循环仪和实验条件。通常可以检测最少量的10-20份模板。

 

  1. 什么是相对和绝对量化?

当与具有已知拷贝数的标准样品比较时,绝对定量计算特定目标片段的总数。相对定量计算样品之间的表达差异; 通常将样品表达谱与管家基因表达水平进行比较。

如需帮助电询:400-080-3779  我们有专业人员解决您的问题

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