- 完成DNA / RNA提取方案需要多长时间？
这取决于您打算使用的样品数量。通常对于5-10个样品，60分钟足以执行整个方案。在开始之前，请确保准备好所有试剂和溶液。
- 我应该使用什么裂解方法从我的样品中获取DNA / RNA？
应该使用的裂解方法取决于细胞的膜和细胞壁特性。如果细胞没有细胞壁，则只能使用裂解缓冲液。虽然如果细胞有细胞壁，我们强烈建议使用酶或机械过程分别破坏细胞壁和细胞壁，如裂解酶或细胞壁。
- DNA / RNA提取方案中预期的浓度范围是多少？
DNA浓度取决于细胞样品中含有的DNA / RNA的量。通常从典型的DNA / RNA提取方案获得1-5μg。
- 是否有可能从少量细胞样本中提取DNA / RNA？
是的。但是，您应该预计DNA浓度低于1微克DNA。
- 我可以从固体样品中提取DNA / RNA吗？
当您使用生物样本进行DNA / RNA提取时，您应该在提取方案中添加上一步。通常，建议使用液氮将固体样品破碎成小体积，以便在添加重悬浮缓冲液后获得细胞悬浮液。
- DNA / RNA的质量标准是什么？
检查Nanodrop中的DNA / RNA纯度时，对于RNA和DNA，您应该分别获得2.1和1.8的A260 / 280比率。A260 / 230比率应接近2且绝不低于1.8。
- 我可以存储DNA / RNA多长时间？
根据您的储存条件，您可以在4°C下立即使用，或在-20°C下储存1-2个月。
- 是否有可能使用具有不同Tm的引物对不同基因进行PCR反应？
有可能的。您只需使用热循环仪的温度梯度设置，并将PCR管放置在正确的温度行或列中，具体取决于热循环仪的功能。
- 我应该使用相同的聚合酶进行任何PCR吗？
可获得大量商业聚合酶，每种聚合酶具有不同的性质和应用。您应该考虑PCR反应的主要目标。
- 我可以使用PCR产物进行分子克隆吗？
PCR的一个应用是产生显着量的特定DNA片段以进行分子克隆。但是，建议在使用PCR产物前进行PCR纯化。PCR试剂可以抑制分子克隆中使用的一些酶。
- 是否需要在PCR之前始终进行DNA提取？
在某些情况下，您不需要进行DNA提取，这是菌落PCR的情况。通常，菌落PCR用于检查样品中是否存在特定片段而不进行DNA提取，通常在分子克隆后进行。该方法使用先前暴露于微波的完整细胞（其使细胞膜更具渗透性），然后添加PCR试剂。
- 我可以使用PCR产生侧翼为限制性位点的片段吗？
如果您将PCR产物用于分子克隆，您可以选择您想要使用的限制酶，然后将正向和反向引物添加到每个限制性位点的序列中。
- 如何在定点突变中使用PCR？
定点诱变方法遵循标准PCR的所有原理，不同之处在于：引物组应包含待产生的核苷酸突变; 聚合酶应该是高保真聚合酶，以避免其他突变。
- 应该选择哪种“管家基因”？
选择在所有测试条件下保持相同表达水平的管家基因至关重要。建议选择一个以上的管家基因并进行初步测试，以验证在测试的实验条件下表达水平是否相同。通常，这些是最常用的管家基因：18S，GAPDH，ACTB。然而，已经表明，在一些样品和条件下，甚至这些基因具有不同的表达模式。
- 在qRT-PCR中使用的重复数是多少？
选择的实验系统将定义要使用的重复数。至少，始终建议对每个样品执行3次重复。
- qRT-PCR的灵敏度范围是多少？
qRT-PCR的灵敏度高度依赖于所用的热循环仪和实验条件。通常可以检测最少量的10-20份模板。
- 什么是相对和绝对量化？
当与具有已知拷贝数的标准样品比较时，绝对定量计算特定目标片段的总数。相对定量计算样品之间的表达差异; 通常将样品表达谱与管家基因表达水平进行比较。
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