ELISA阻断缓冲液优化

ELISA阻断缓冲液优化

ELISA阻断缓冲液优化

选择正确的阻塞缓冲区

涂覆ELISA板的过程依赖于固相的被动结合活性,其将生物分子固定在孔表面上。没有适当的阻断,平板将与抗原或检测抗体一起结合检测抗体,导致高背景信号和低灵敏度。在涂覆后将板暴露于封闭缓冲液导致孔底部上的游离结合位点变得饱和,消除了非特异性结合的可能性并且极大地改善了信噪比。

有多种阻断缓冲液,其中一种不适用于板型,分析形式和检测系统的每种组合。每个阻塞缓冲区代表减少背景和维持特异性之间的折衷。使用本指南可帮助确定哪种类型的阻塞缓冲区最适合您的特定应用。

基于洗涤剂的阻塞缓冲区

非离子型洗涤剂,例如吐温-20,提供了便利的廉价封闭溶液。但是,不推荐使用洗涤剂作为唯一的阻塞方法:洗涤剂是临时阻滞剂,因为它们可以通过用水或水性缓冲液洗涤来剥离。洗涤剂主要用作二级封闭剂; 当包含在洗涤缓冲液中时,洗涤剂可以主动阻断板表面上暴露的位点,因为弱相关蛋白被洗掉。

非离子洗涤剂的优点非离子洗涤剂的缺点
§  尽管浓度要求较高,但价格低廉

§  高度稳定,能够在室温下作为工作溶液储存

§  通过促进弱结合分子的解离和阻断所得的暴露结合位点来增加洗涤的有效性

§  作为唯一阻挡方法无效

§  可能导致非共价相互作用结合的分子解离

§  可能会干扰HRP检测系统

§  与脂多糖不相容,因为它们能够胜过这些分子

蛋白质阻断剂

蛋白质阻断剂是一种永久性阻断溶液,只需对板进行一次处理即可进行有效阻断。还可以将蛋白质阻断剂添加到后续步骤中使用的稀释剂中以进一步降低背景信号。最常见的阻断蛋白包括:牛血清白蛋白(BSA),脱脂奶粉和全血清。每个都有自己的优点和缺点:

BSA脱脂奶粉全血清正常
优点§  便宜

§  浓度低至1-3%时有效

§  记录良好的功效

§  与蛋白A兼容

§  便宜

§  浓度低至0.1-0.5%时有效

§  干燥形式高度稳定

§  更有效地阻止共价相互作用

§  有效阻断所有非特异性相互作用,包括蛋白质 – 蛋白质相互作用

§  作为蛋白质稳定剂

缺点§  由于脂肪酸含量不同,批次间差异很大

§  可能与某些类别的抗体交叉反应

§  阻断共价相互作用的效果较差

§  可能与磷酸特异性抗体交叉反应

§  与碱性磷酸酶不相容

§  可能会导致整体更高的背景

§  与蛋白A和抗IgG抗体交叉反应

§  昂贵

§  需要高达10%的浓度

关键词: ELISA优化,阻断ELISA,缓冲液,蛋白质阻断剂,去污剂阻断剂

 

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