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ELISA检测(酶联免疫吸附测定实验)常见问题及解决方案

ELISA检测中一些最常遇到的问题的可能原因和解决方案

1.    弱或无信号

 

可能的原因
1阻止涂层溶液中的蛋白质§  消除涂层溶液中的蛋白质
2捕获抗体(或抗原)不与板结合§  使用ELISA板,而不是组织培养板

§  尝试更长的涂布时间

§  增加涂料组分的浓度

3标准问题§  使用新样本

§  检查标准是否得到妥善处理

4孵化时间太短§  遵循制造商指南(如果问题仍然存在,请尝试将样品在4°C下孵育过夜)
孵化温度太低§  确保孵育在正确的温度下进行

§  在继续之前,所有试剂(包括板)应在室温下或按制造商的建议进行

6样本类型不兼容§  使用已知化验的样品检测阳性对照(在实验中包括此类对照)
7不相容的分析缓冲液§  确保化验缓冲液与目标靶标兼容
8目标低于检测限§  减少稀释因子或浓缩样品
10不正确/不足/无基材§  检查基质身份

§  增加底物的浓度或量

§  遵循制造商指南

11不正确/不足/无抗体§  检查抗体身份

§  用更高的抗体浓度重复测定,找到最适合实验的测定

12将抗体在4℃下储存数周或进行反复的冻融循环§  使用保存在-20°C或以下的新鲜抗体等分试样
13添加/准备的试剂不正确; 缺少试剂§  检查方案,确保以正确的顺序添加正确的试剂并准备好正确的浓度(例如,HRP标记的抗体的TMB)
14过期/污染的试剂§  制造和使用新鲜/未污染的试剂
15存在酶抑制剂§  在HRP反应中避免使用叠氮化钠

§  避免AP反应中的磷酸盐

16组件的存储不正确§  套件级别的双重检查存储条件(大多数套件需要存储在4°C)
17超强力洗板§  轻轻移液洗涤缓冲液(手动方法)

§  确保压力正确(自动清洗系统)

18井干了§  对于所有孵育,使用密封膜或胶带覆盖板
19用移液管或移液器吸头刮擦孔§  小心地将溶液分配/吸出井
20在不正确的检测波长下读板§  使用推荐的波长/滤波器

§  确保为所用基材类型正确设置读板器

21色彩发展缓慢§  使用前立即准备基质

§  允许更长的孵化

§  确保库存溶液未过期且未受污染

22表位识别受到板吸附的阻碍§  在涂覆到平板上之前将肽与大载体蛋白缀合

2.    饱和信号

 

可能的原因
1样品浓度高§  使用更高的样品稀释液(通过滴定分析确定最佳稀释度)
2过多的基材§  降低底物浓度或数量:遵循制造商指南(ELISA试剂盒提供的底物可能需要进一步稀释)
3使用前更换基材颜色§  使用前立即制作基材
4非特异性抗体结合§  在涂料溶液中尝试不同的配方

§  确保对井进行预处理以防止非特异性结合

§  使用亲和纯化的抗体,优选预先吸附的抗体。

§  使用来自同一物种的血清(5-10%)作为二抗(也建议使用牛血清)

孵化时间太长§  遵循制造商指南(如果问题仍然存在,请尝试将样品在4°C下孵育过夜)
6抗体过量§  用较低的抗体浓度重复测定,找到最适合实验的方法
7受金属或HRP污染的缓冲液§  制作并使用新鲜缓冲液
9洗涤不足§  遵循制造商指南

§  在每个洗涤步骤结束时,将板轻弹在水槽上并将板轻拍在纸巾上

10不使用或重复使用的板式密封剂§  在孵育期间,盖板用板密封剂。

§  每次从板上取下用过的密封剂时,请使用新的密封剂

11在不正确的检测波长下读板§  使用推荐的波长/滤波器

§  确保为所用基材类型正确设置读板器

12读板前的时间过长§  添加基材后30分钟内读取您的印版(如果在此时间范围内未执行读数,请在印版中显示足够的颜色后添加停止溶液)

高背景

可能的原因
1洗涤不足§  遵循制造商指南

§  在每个洗涤步骤结束时,将板轻弹在水槽上并将板轻拍在纸巾上

2无效/污染阻塞缓冲区§  尝试更高的阻断蛋白浓度

§  增加阻塞时间

§  使用新鲜缓冲液

3抗体过量§  用较低的抗体浓度重复测定,找到最适合实验的方法
4多余的基材§  减少浓度或底物量

§  遵循制造商指南(注意:ELISA试剂盒提供的底物可能需要进一步稀释)

交叉反应性(检测抗体与包被抗体反应)§  运行适当的控件
6非特异性抗体结合§  在涂料溶液中尝试不同的配方

§  确保对井进行预处理以防止非特异性结合

§  使用亲和纯化的抗体,优选预先吸附的抗体

§  使用来自同一物种的血清(5-10%)作为二抗(也建议使用牛血清)

7缓冲区中的Tween不足§  使用含有0.05%吐温的PBS
8洗涤缓冲液中的盐浓度不理想§  优化盐浓度,因为高浓度可以减少非特异性相互作用
9孵化温度太高§  优化测定的孵育温度(抗体在非常特定的温度下最佳结合)
10试剂没有正确混合§  在将溶液移液到孔中之前彻底混合所有试剂和样品
11空白污染样品§  在空白和样品之间切换时更换移液器吸头

§  盖上盖子,以避免井之间溢出

12被酶污染的样品§  仅用底物测试样品以检查污染的酶
13受污染的TMB底物§  使用干净的容器检查基质是否未被污染(TMB基质在添加到孔之前应该是透明和无色的)
14底物在光照下孵化§  在黑暗中进行底物孵育或遵循制造商的建议
15在孵育期间从孔中蒸发溶液不均匀§  始终在盘子上盖上盖子
16在添加底物时在孔中产生沉淀物§  增加样品的稀释倍数或降低底物浓度
17孵化时间太长§  遵循制造商指南(如果问题仍然存在,请尝试将样品在4°C下孵育过夜)
18标准曲线稀释度不正确§  检查移液技术

§  仔细检查计算

19孵化过程中堆积的板,导致温度分布不均匀§  避免堆叠板
20肮脏或有缺陷的板§  清洁板底
21不间断的色彩开发§  使用Stopping解决方案来防止过度开发
22读板前的时间过长§  添加基材后30分钟内读取您的印版(如果在此时间范围内未执行读数,请在印版中显示足够的颜色后添加停止溶液)

§  注意:即使添加停止溶液后颜色仍在继续发展(尽管速度较慢)

23板读数设置不正确§  使用推荐的波长/滤波器

§  确保为所用基材类型正确设置读板器

4.    灵敏度低

 

可能的原因
1分析格式不够灵敏§  切换到更灵敏的检测系统(例如比色到化学发光)

§  切换到更敏感的分析类型(例如直接ELISA到夹心ELISA)

§  增加孵化时间和/或温度

2ELISA试剂盒的储存不当§  按建议储存所有试剂

§  注意:所有试剂可能没有相同的存储要求

3目标不足§  减少样品稀释或浓缩样品
4非活性基质§  确保报告酶具有预期的活性
目标对井的吸附差§  将目标共价连接到井
6底物不足§  增加底物的浓度或量
7样本类型不兼容§  使用已知化验的样品检测阳性对照

§  在实验中包含阳性对照

8缓冲液和样品中的成分干扰§  检查试剂中是否存在任何干扰性化学物质,例如抗体中的叠氮化钠会抑制HRP酶; 用作血浆收集的抗凝血剂的EDTA抑制酶促反应
9混合或替代不同试剂盒中的试剂§  避免混合不同套件中的组件
10板读数设置不正确§  使用推荐的波长/滤波器

§  确保为所用基材类型正确设置读板器

5.    标准曲线差

 

可能的原因
1标准解决方案不当§  确认稀释正确完成

§  根据需要制作新的标准曲线

2标准不正确地重组§  在打开之前简单地旋转小瓶

§  重新配制后检查未溶解的物质

3标准降级§  按照建议存储和处理标准

§  使用前不超过两小时准备标准

4曲线拟合不正确§  尝试使用不同的比例绘图,例如log-log,5参数逻辑曲线拟合
移液错误§  使用校准的移液器和适当的移液技术
6洗涤不足§  遵循制造商指南

§  在每个洗涤步骤结束时,将板轻弹在水槽上并将板轻拍在纸巾上

7试剂混合不良§  彻底混合试剂
8试剂对板的吸附差/可变§  延长孵化时间

§  检查涂层缓冲液

§  根据需要使用不同的板

§  检查样品的均匀性

9在孵化期间堆积的板材§  如果不使用旋转板,请保持板分离
10肮脏或有缺陷的板§  清洁板底

6.    复制数据不佳

 

可能的原因
1在井中冒泡§  确保在读板前没有气泡
2井的清洗不充分§  小心洗井

§  遵循推荐的协议

§  检查洗板机的所有端口是否畅通无阻

3不完全的试剂混合§  确保所有试剂彻底混合
4移液不一致§  使用校准的移液器和适当的移液技术

§  每次从板上取下用过的密封剂时,请使用新的密封剂

样品制备或储存不一致§  确保一致的样品制备和最佳样品储存条件(例如最小化冻/融循环)
6样品中的颗粒§  通过离心除去颗粒
7不使用或重复使用的板式密封剂§  在孵育期间,盖板用板密封剂

§  每次从板上取下用过的密封剂时,请使用新的密封剂

8跨井污染§  确保平板密封剂和移液器吸头不会被试剂污染
9边缘效应(外围井的OD值高于或低于中心井)§  除非另有说明,否则确保将板和试剂保持在室温下,然后移液到孔中

§  在孵育期间,用板密封剂完全密封板并避免堆叠板

7.    不一致的分析 – 分析结果

 

可能的原因
1井的清洗不充分§  小心洗井

§  遵循推荐的协议

§  检查洗板机的所有端口是否畅通无阻

2孵化温度的变化§  坚持推荐的孵化温度

§  避免在环境条件变化的区域孵育平板

3协议的变化§  从运行到运行坚持相同的协议
4不使用或重复使用的板式密封剂§  在孵育期间,盖板用板密封剂

§  每次从板上取下用过的密封剂时,请使用新的密封剂

稀释不正确§  确认稀释液是否正确用于标准溶液等

§  根据需要制作新的标准曲线

6受污染的缓冲区§  制作并使用新鲜缓冲液
7在孵化期间堆积的板材§  如果不使用旋转板,请保持板分离

8.    慢色发展

 

可能的原因
1基材太旧,污染或在不正确的pH值下使用§  在正确的pH值下制作和使用新鲜底物:应在使用前立即制备
2过期/受污染的解决方案§  制作和使用新鲜试剂
3孵育温度不正确§  除非另有说明,否则确保将板和试剂保持在室温下,然后移液到孔中

§  在孵育期间,用板密封剂完全密封板并避免堆叠板

4抗体浓度低§  用更高的抗体浓度重复测定,找到最适合实验的测定
底物浓度低§  向孔中添加更多底物

§  使用前制作基质不超过一小时

§  注意:典型的ELISA灵敏度为~0.1 pg / mL,精确值取决于所用的抗体。

9.    平板成像问题

 

可能的原因
1采集后的过饱和图像§  使用全分辨率图像分析结果(不要使用jpeg或其他压缩格式)
2图像中的模糊点§  在拍摄新图像之前重新对焦相机
3重复的像素值或矩形斑点§  使用较低的bin大小,较高的图像分辨率和/或无损文件类型
4图像中的标准§  缩短采集时间

 

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