ELISA试剂盒使用方法_深圳南博屹生物科技有限公司

试剂准备
1. 标准解决方案
  - 10,000 pg / mL：将1 mL样品稀释缓冲液加入一个标准管（每管10 ng）中并充分混合。注意：将此溶液在4°C下保存最多12小时（或-20°C，48小时）并避免冻融循环。
  - 5,000 pg / mL：将3 mL 10,000 pg / mL与0.3 mL样品稀释缓冲液混合并充分混合。
  - 2,500 pg / mL：将3 mL 5,000 pg / mL与0.3 mL样品稀释缓冲液混合并充分混合。
  - 进行类似稀释，直至达到这些浓度（pg / mL）的标准溶液：
  - 1,250,625,312,156和78。
  - 将100μL每种稀释的标准溶液加入适当的空孔中。重复一式两份或一式三份以确保准确性。

注意：标准溶液最好在2小时内使用。

生物素化抗体
- 通过乘以1 mL /孔和所需的孔数计算测定所需的总体积。在计算的井数中添加2-3个额外的井，以解释可能的移液错误。
- 通过进行1：100稀释（对于每1μL浓缩抗体，添加99μL抗体稀释缓冲液）并彻底混合，产生所需体积的稀释抗体。
抗生物素蛋白 – 生物素 – 过氧化物酶复合物（ABC）
- 通过乘以1 mL /孔和所需的孔数计算测定所需的总体积。在计算的井数中添加2-3个额外的井，以解释可能的移液错误。
- 通过进行1：100稀释（对于每1μL浓缩的ABC溶液，添加99μLABC稀释缓冲液）并彻底混合，产生所需体积的稀释ABC溶液。

注意：稀释的ABC溶液不应在实验前1小时以上准备。

来自南博屹生物的所有ELISA试剂盒均使用形式和生物素 – 链霉抗生物素蛋白化学。我们的ELISA检测需要稀释标准溶液，生物素化抗体（检测抗体）和抗生物素蛋白 – 生物素 – 过氧化物酶复合物。

在碳酸氢盐/碳酸盐抗原包被缓冲液（100mM NaHCO 3在去离子水中; pH调节至6）中将捕获抗体稀释至最终浓度为1-10μg/ mL。
移取100μL稀释的抗体至微量滴定板的每个孔。
用粘性塑料盖住平板并在4℃下孵育过夜（或37℃孵育30分钟）。
除去涂层溶液并用200μLPBS（磷酸盐缓冲盐水）缓冲液（10mM Na 2 HPO 4和8mM NaH 2 PO 4在去离子水中含0.2％吐温20; pH调节至7.4）洗涤板3次，每次5分钟。可以通过在水槽上轻弹板来移除涂层/清洗溶液。可以通过在纸巾上轻拍或通过抽吸来移除剩余的液滴。不要让井随时变干。

注意：稀释的ABC溶液不应在实验前1小时以上准备。

样品（抗原）孵育
- 使用前立即用封闭缓冲液稀释样品。应根据抗体制造商通过滴定测定确定最佳稀释度。
- 移取100μL每种稀释的样品溶液并控制每个空孔。重复一式两份或一式三份以确保准确性。阴性对照应该是物种和同种型匹配以及在PBS缓冲液中稀释的非特异性免疫球蛋白。
- 用粘性塑料盖住板，在室温下孵育2小时。
- 取出孔中的内容物，每次用200μLPBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。如涂布步骤中所述，轻拍板并拍打板。
生物素化抗体孵育
- 用对照，标准溶液和稀释样品移取100μL稀释的抗体到孔中。
- 用粘性塑料盖住平板并在37℃下孵育1小时（或在室温下孵育2小时）。这些孵育时间应足以接收强烈信号。但是，如果观察到弱信号，则在4°C温育过夜以获得更强的信号。
- 取出孔中的内容物，每次用200μLPBS洗涤3次，每次5分钟。如涂布步骤中所述，轻拍板并拍打板。
ABC孵化
- 用对照，标准溶液和稀释样品移取100μL稀释的ABC溶液到孔中。
- 用粘性塑料盖住板并在37℃下孵育5小时。
- 取出孔中的内容物，每次用200μLPBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。如涂布步骤中所述，轻拍板并拍打板。
基材准备

使用前立即准备基质溶液或将预制基质置于室温。用于信号检测的两种广泛使用的酶是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），它们相应的底物，终止溶液，检测吸收波长和产生的颜色如下：

* TMB：3,3’，5,5′-四甲基联苯胺; pNPP：对硝基苯基磷酸酯

注意：

信号检测
- 用对照，标准溶液和稀释样品移取90μL底物溶液至孔中。
- 将板在37°C黑暗中孵育。如果使用TMB，则在具有最浓缩溶液的孔中将观察到蓝色阴影。其他井可能没有明显的颜色。
- 15分钟后，应在阳性孔中显色。在充分显色后，将100μL终止溶液移液至适当的孔（如果需要）。
- 用平板读数器读取每个孔的吸光度（OD：光密度）。
数据分析
- 使用稀释的标准溶液产生的数据准备标准曲线。使用Y轴上的吸光度（线性）和X轴上的浓度（对数刻度）。
- 从标准曲线解释样品浓度。