酶联免疫吸附试验

ELISA试剂盒使用方法

  1. 试剂准备
    1. 标准解决方案
      • 10,000 pg / mL:将1 mL样品稀释缓冲液加入一个标准管(每管10 ng)中并充分混合。注意:将此溶液在4°C下保存最多12小时(或-20°C,48小时)并避免冻融循环。
      • 5,000 pg / mL:将3 mL 10,000 pg / mL与0.3 mL样品稀释缓冲液混合并充分混合。
      • 2,500 pg / mL:将3 mL 5,000 pg / mL与0.3 mL样品稀释缓冲液混合并充分混合。
      • 进行类似稀释,直至达到这些浓度(pg / mL)的标准溶液:
      • 1,250,625,312,156和78。
      • 将100μL每种稀释的标准溶液加入适当的空孔中。重复一式两份或一式三份以确保准确性。

注意:标准溶液最好在2小时内使用。

  1. 生物素化抗体
    • 通过乘以1 mL /孔和所需的孔数计算测定所需的总体积。在计算的井数中添加2-3个额外的井,以解释可能的移液错误。
    • 通过进行1:100稀释(对于每1μL浓缩抗体,添加99μL抗体稀释缓冲液)并彻底混合,产生所需体积的稀释抗体。
  2. 抗生物素蛋白 – 生物素 – 过氧化物酶复合物(ABC)
    • 通过乘以1 mL /孔和所需的孔数计算测定所需的总体积。在计算的井数中添加2-3个额外的井,以解释可能的移液错误。
    • 通过进行1:100稀释(对于每1μL浓缩的ABC溶液,添加99μLABC稀释缓冲液)并彻底混合,产生所需体积的稀释ABC溶液。

注意:稀释的ABC溶液不应在实验前1小时以上准备。

  1. ELISA协议

来自南博屹生物的所有ELISA试剂盒均使用形式和生物素 – 链霉抗生物素蛋白化学。我们的ELISA检测需要稀释标准溶液,生物素化抗体(检测抗体)和抗生物素蛋白 – 生物素 – 过氧化物酶复合物。

  1. 捕获抗体涂层
  • 在碳酸氢盐/碳酸盐抗原包被缓冲液(100mM NaHCO 3在去离子水中; pH调节至6)中将捕获抗体稀释至最终浓度为1-10μg/ mL。
  • 移取100μL稀释的抗体至微量滴定板的每个孔。
  • 用粘性塑料盖住平板并在4℃下孵育过夜(或37℃孵育30分钟)。
  • 除去涂层溶液并用200μLPBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液(10mM Na 2 HPO 4和8mM NaH 2 PO 4在去离子水中含0.2%吐温20; pH调节至7.4)洗涤板3次,每次5分钟。可以通过在水槽上轻弹板来移除涂层/清洗溶液。可以通过在纸巾上轻拍或通过抽吸来移除剩余的液滴。不要让井随时变干。
  1. 闭塞
  • 每孔移取200μL封闭缓冲液(PBS缓冲液中5%w / v脱脂奶粉)以阻断残留的蛋白质结合位点。或者,BSA或BlockACE可用于替代脱脂奶粉。
  • 用粘性塑料盖住平板并在37℃(或4℃过夜)下孵育1-2小时。
  • 取出封闭液,每次用200μLPBS将板洗2次,每次5分钟。如涂布步骤中所述,轻拍板并拍打板。
  1. 试剂准备
    • 准备稀释的标准溶液,生物素化抗体和ABC溶液,如上述试剂准备部分所示。

注意:稀释的ABC溶液不应在实验前1小时以上准备。

  1. 样品(抗原)孵育
    • 使用前立即用封闭缓冲液稀释样品。应根据抗体制造商通过滴定测定确定最佳稀释度。
    • 移取100μL每种稀释的样品溶液并控制每个空孔。重复一式两份或一式三份以确保准确性。阴性对照应该是物种和同种型匹配以及在PBS缓冲液中稀释的非特异性免疫球蛋白。
    • 用粘性塑料盖住板,在室温下孵育2小时。
    • 取出孔中的内容物,每次用200μLPBS缓冲液洗涤3次,每次5分钟。如涂布步骤中所述,轻拍板并拍打板。
  2. 生物素化抗体孵育
    • 用对照,标准溶液和稀释样品移取100μL稀释的抗体到孔中。
    • 用粘性塑料盖住平板并在37℃下孵育1小时(或在室温下孵育2小时)。这些孵育时间应足以接收强烈信号。但是,如果观察到弱信号,则在4°C温育过夜以获得更强的信号。
    • 取出孔中的内容物,每次用200μLPBS洗涤3次,每次5分钟。如涂布步骤中所述,轻拍板并拍打板。
  3. ABC孵化
    • 用对照,标准溶液和稀释样品移取100μL稀释的ABC溶液到孔中。
    • 用粘性塑料盖住板并在37℃下孵育5小时。
    • 取出孔中的内容物,每次用200μLPBS缓冲液洗涤3次,每次5分钟。如涂布步骤中所述,轻拍板并拍打板。
  4. 基材准备

使用前立即准备基质溶液或将预制基质置于室温。用于信号检测的两种广泛使用的酶是辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP),它们相应的底物,终止溶液,检测吸收波长和产生的颜色如下:

基质*停止解决方案吸光度(nm)颜色开发
HRPTMB2M H2SO4450黄色
美联社物pNPP0.75M NaOH405黄色

* TMB:3,3’,5,5′-四甲基联苯胺; pNPP:对硝基苯基磷酸酯

注意:

  • 使用前,TMB基板必须在37°C下保持30分钟。
  • 过氧化氢也可以作为HRP的底物。
  • 叠氮化钠是HRP的抑制剂。如果使用HRP标记的缀合物进行检测,则不要将叠氮化物包括在缓冲液或洗涤溶液中。
  1. 信号检测
    • 用对照,标准溶液和稀释样品移取90μL底物溶液至孔中。
    • 将板在37°C黑暗中孵育。如果使用TMB,则在具有最浓缩溶液的孔中将观察到蓝色阴影。其他井可能没有明显的颜色。
    • 15分钟后,应在阳性孔中显色。在充分显色后,将100μL终止溶液移液至适当的孔(如果需要)。
    • 用平板读数器读取每个孔的吸光度(OD:光密度)。
  2. 数据分析
    • 使用稀释的标准溶液产生的数据准备标准曲线。使用Y轴上的吸光度(线性)和X轴上的浓度(对数刻度)。
    • 从标准曲线解释样品浓度。

 

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