ELISA组织样本制做方法指南

以下程序为制备用于ELISA测定的常用样品提供了一般情况下的指导。具体请查阅文献,从而了解与您的新实验相似的实验案例。在本文中,涵盖以下示例:

  1. 细胞培养上清液
    • 将细胞培养基在1,500rpm和4℃下离心10分钟。
    • 立即测定或等分上清液并保持在-80℃(避免冷冻/解冻循环)。
  2. 细胞培养(条件)培养基

由于血清倾向于含有可能产生显着背景信号的细胞因子,我们建议制备无血清或低血清培养基样品。如果有必要测试含有血清的培养基,我们还建议运行未培养的培养基空白以获得基线信号,然后可以从培养的培养基样品数据中减去该基线信号。

第1天

  • 在完全生长培养基(含血清)中培养细胞直至达到所需的汇合水平。
  • 注意:种子细胞的最佳数量因细胞类型而异,可能需要凭经验确定。我们建议在具有完全生长培养基的100mm组织培养板中接种约100万个细胞。

第4天

  • 移除生长培养基,用2-3 mL温PBS轻轻洗涤细胞。
  • 重复洗涤步骤。
  • 除去PBS并用无血清或含低血清的培养基(例如含有2%小牛血清的培养基)替换培养基。
  • 孵育1-2天。

第6天

  • 收集媒介。
  • 以1,500rpm和4℃离心10分钟。
  • 将上清液等分并保持在-80ºC直至实验(避免冷冻/解冻循环)。以这种方式制备的大多数样品可以储存至少一年。
  1. 细胞裂解液
    • 在PBS中收集并冲洗细胞。
    • 在裂解缓冲液(例如哺乳动物细胞蛋白质提取试剂,Boster目录号:AR0103)中彻底均化和裂解细胞。
    • 将细胞裂解物在约10,000xg和4℃下离心5分钟。
    • 立即测定或等分上清液并保持在-80℃(避免冷冻/解冻循环)。

裂解缓冲液指南

  • 避免使用超过1%的SDS或其他强变性洗涤剂(一般来说,非离子型洗涤剂,如Triton X-100或NP-40是最好的。两性离子洗涤剂,如CHAPS或温和的离子洗涤剂,如脱氧胆酸钠可以起作用)。
  • 不要使用超过2%v / v的总洗涤剂。
  • 避免使用叠氮化钠。
  • 避免使用超过10 mM的还原剂(例如二硫苏糖醇,巯基乙醇)。
  1. 组织匀浆
    • 用PBS冲洗组织以去除多余的血液。
    • 在冰冷的缓冲液中将组织切成1-2mm的冰块,保持在冰上立即均化或在-80℃下备用。
    • 准备提取缓冲液。它可以提前准备并储存在4°C。
      • 100mM Tris,4
      • 150 mM NaCl
      • 1 mM EGTA
      • 1 mM EDTA
      • 1%Triton X-100 0.5%
      • 5%脱氧胆酸钠
    • 在使用之前,必须用以下补充提取缓冲液以产生完整的提取缓冲液。
      • 磷酸酶抑制剂鸡尾酒[按制造商的指示]
      • 蛋白酶抑制剂鸡尾酒[按制造商的指示]
      • PMSF(苯基甲基磺酰基Floride)至1mM
    • 对于每1mg组织,向管中加入500μL完全提取缓冲液并均质化。
    • 用500μL提取缓冲液冲洗均化器2X的刀片。
    • 将样品置于4℃的振荡器上1小时。
    • 将样品以约10000×g离心5分钟。
    • 立即测定或等分上清液(可溶性蛋白质提取物)并保持在-80℃(避免冷冻/解冻循环)。
  2. 组织(骨)
    • 在4M盐酸胍和蛋白酶抑制剂中提取去矿化的骨样品。
    • 将最终样品溶解在2M盐酸胍中。
  3. 血清
    • 将全血收集到没有添加剂的管中。
    • 将血液在室温下保持30分钟。
    • 在3,000rpm和4℃下离心10分钟。
    • 立即测定或等分上清液(血清)并保持在-80℃(避免冷冻/解冻循环)。

注意:收集血清样本时应避免溶血。那些经历过溶血的样品可能会增加HRP-缀合的ELISA测定中的非特异性染色。

  1. 等离子体
    • 将全血收集到含有抗凝血剂的管中(不同的蛋白质可能需要不同的抗凝血剂,有关抗凝剂使用的详细信息,请参见数据表)。
    • 在3,000rpm和4℃下离心10分钟。
    • 立即测定或等分上清液(血浆)并保持在-80℃(避免冷冻/解冻循环)。
  2. 尿
    • 将尿液收集到无菌或一次性容器中(必须立即使用新鲜尿液样本或保存,以避免产生内源性HRP的细菌繁殖,从而产生潜在的假阳性结果)。
    • 以10,000xg离心样品1分钟。
    • 立即测定或等分上清液并保持在-80℃。(避免冻/融循环)。
  3. 唾液
    • 使用收集装置收集唾液,没有任何蛋白质结合或过滤能力(例如Salivette)。
    • 在10,000 xg和4°C下离心2分钟。
    • 立即测定或等分上清液并保持在-80℃(避免冷冻/解冻循环)。
  4. 牛奶
    • 在1500×g和4℃下离心15分钟。
    • 收集含水部分并在此过程中重复3次。
    • 通过2μm过滤器过滤。
    • 立即测定或等分上清液并保持在-80℃(避免冷冻/解冻循环)。

ELISA样品制备的一般提示:

  1. 血清,血浆,细胞和组织提取物通常用结合缓冲液稀释50%。
  2. 匀浆的总蛋白质浓度应至少为1 mg / mL。但是,2 mg / mL或更高会更好。
  3. 收集的样品可以保存不同的时间:48小时(2-8°C),1个月(-20°C)或6个月(-70°C)。
  4. 裂解物的蛋白质浓度可通过总蛋白质测定来确定,所述总蛋白质测定不受诸如二辛可宁酸(BCA)测定的去污剂的抑制。每个样品的体积也可以标准化,以便为每个测定提供相同量的总蛋白质。

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