ELISA组织样本制做方法指南_深圳南博屹生物科技有限公司

以下程序为制备用于ELISA测定的常用样品提供了一般情况下的指导。具体请查阅文献，从而了解与您的新实验相似的实验案例。在本文中，涵盖以下示例：

由于血清倾向于含有可能产生显着背景信号的细胞因子，我们建议制备无血清或低血清培养基样品。如果有必要测试含有血清的培养基，我们还建议运行未培养的培养基空白以获得基线信号，然后可以从培养的培养基样品数据中减去该基线信号。

第1天

第4天

第6天

细胞裂解液
- 在PBS中收集并冲洗细胞。
- 在裂解缓冲液（例如哺乳动物细胞蛋白质提取试剂，Boster目录号：AR0103）中彻底均化和裂解细胞。
- 将细胞裂解物在约10,000xg和4℃下离心5分钟。
- 立即测定或等分上清液并保持在-80℃（避免冷冻/解冻循环）。

裂解缓冲液指南

避免使用超过1％的SDS或其他强变性洗涤剂（一般来说，非离子型洗涤剂，如Triton X-100或NP-40是最好的。两性离子洗涤剂，如CHAPS或温和的离子洗涤剂，如脱氧胆酸钠可以起作用）。
不要使用超过2％v / v的总洗涤剂。
避免使用叠氮化钠。
避免使用超过10 mM的还原剂（例如二硫苏糖醇，巯基乙醇）。

组织匀浆
- 用PBS冲洗组织以去除多余的血液。
- 在冰冷的缓冲液中将组织切成1-2mm的冰块，保持在冰上立即均化或在-80℃下备用。
- 准备提取缓冲液。它可以提前准备并储存在4°C。
  - 100mM Tris，4
  - 150 mM NaCl
  - 1 mM EGTA
  - 1 mM EDTA
  - 1％Triton X-100 0.5％
  - 5％脱氧胆酸钠
- 在使用之前，必须用以下补充提取缓冲液以产生完整的提取缓冲液。
  - 磷酸酶抑制剂鸡尾酒[按制造商的指示]
  - 蛋白酶抑制剂鸡尾酒[按制造商的指示]
  - PMSF（苯基甲基磺酰基Floride）至1mM
- 对于每1mg组织，向管中加入500μL完全提取缓冲液并均质化。
- 用500μL提取缓冲液冲洗均化器2X的刀片。
- 将样品置于4℃的振荡器上1小时。
- 将样品以约10000×g离心5分钟。
- 立即测定或等分上清液（可溶性蛋白质提取物）并保持在-80℃（避免冷冻/解冻循环）。
组织（骨）
- 在4M盐酸胍和蛋白酶抑制剂中提取去矿化的骨样品。
- 将最终样品溶解在2M盐酸胍中。
血清
- 将全血收集到没有添加剂的管中。
- 将血液在室温下保持30分钟。
- 在3,000rpm和4℃下离心10分钟。
- 立即测定或等分上清液（血清）并保持在-80℃（避免冷冻/解冻循环）。

注意：收集血清样本时应避免溶血。那些经历过溶血的样品可能会增加HRP-缀合的ELISA测定中的非特异性染色。

等离子体
- 将全血收集到含有抗凝血剂的管中（不同的蛋白质可能需要不同的抗凝血剂，有关抗凝剂使用的详细信息，请参见数据表）。
- 在3,000rpm和4℃下离心10分钟。
- 立即测定或等分上清液（血浆）并保持在-80℃（避免冷冻/解冻循环）。
尿
- 将尿液收集到无菌或一次性容器中（必须立即使用新鲜尿液样本或保存，以避免产生内源性HRP的细菌繁殖，从而产生潜在的假阳性结果）。
- 以10,000xg离心样品1分钟。
- 立即测定或等分上清液并保持在-80℃。（避免冻/融循环）。
唾液
- 使用收集装置收集唾液，没有任何蛋白质结合或过滤能力（例如Salivette）。
- 在10,000 xg和4°C下离心2分钟。
- 立即测定或等分上清液并保持在-80℃（避免冷冻/解冻循环）。
牛奶
- 在1500×g和4℃下离心15分钟。
- 收集含水部分并在此过程中重复3次。
- 通过2μm过滤器过滤。
- 立即测定或等分上清液并保持在-80℃（避免冷冻/解冻循环）。

ELISA样品制备的一般提示：

血清，血浆，细胞和组织提取物通常用结合缓冲液稀释50％。
匀浆的总蛋白质浓度应至少为1 mg / mL。但是，2 mg / mL或更高会更好。
收集的样品可以保存不同的时间：48小时（2-8°C），1个月（-20°C）或6个月（-70°C）。
裂解物的蛋白质浓度可通过总蛋白质测定来确定，所述总蛋白质测定不受诸如二辛可宁酸（BCA）测定的去污剂的抑制。每个样品的体积也可以标准化，以便为每个测定提供相同量的总蛋白质。

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