浓度绘制ELISA数据

ELISA基本原理,ELISA的工作原理 – 免疫分析

什么是ELISA

ELISA(酶联免疫吸附测定)是一种基于平板的测定技术,设计用于检测和定量肽,蛋白质,抗体和激素。在ELISA中,必须将抗原固定在固体表面上,然后与与酶连接的抗体复合。通过与底物一起温育来评估缀合的酶活性以产生可测量的产物来完成检测。检测策略中最关键的元素是高度特异性的抗体 – 抗原相互作用。

ELISA通常在96孔(或384孔)聚苯乙烯板中进行,其将被动地结合抗体和蛋白质。正是这种试剂的结合和固定使得ELISAs易于设计和执行。将ELISA的反应物固定在微孔板表面上使得在测定期间易于将结合的物质与未结合的物质分离。这种洗去非特异性结合材料的能力使ELISA成为测量原油制剂中特定分析物的有力工具。

 

ELISA基础知识/ ELISA原理

酶联免疫吸附测定的操作原理与其他免疫测定技术非常相似。ELISA依赖于特异性抗体结合靶抗原,以及检测系统以指示抗原结合的存在和数量。为了最大限度地提高分析的灵敏度和精确度,必须用高亲和力的抗体仔细涂覆培养板 – 这是南博屹生物掌握的一个过程。

 

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  • 灵敏度– 一位数皮克检测限
  • 特异性– 严格验证的捕获抗体具有低交叉反应性
  • 稳定性– 保证长达一年的敏感性
  • 服务– 南博屹生物提供快速,富有洞察力的技术支持

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在南博屹生物,我们的使命是通过提供获得更好结果所需的高质量ELISA试剂盒来支持免疫学,神经科学,癌症等领域的研究。我们提供检测IL-6,IL-8,IL-10,EGF,VEGF和800多种其他靶标的ELISA试剂盒。我们使用生物相关基质彻底验证每个试剂盒,包括细胞培养上清液,血清,血浆,细胞裂解液和组织,以确保我们的试剂盒能够为任何样品类型提供一致的结果。浏览我们的目录以找到您的目标,或者查看我们的研究领域迷你目录,以查看您所在研究领域的ELISA试剂盒。

一般ELISA程序

*这是ELISA工作原理的概念性解释。单击此处获取逐步ELISA方案。

除非您使用的是具有预先涂有抗体的平板的试剂盒,否则ELISA开始于包被步骤,其中由靶抗原或抗体组成的第一层被吸附到96孔聚苯乙烯板上。接下来是阻塞步骤,其中所有未结合的位点都涂有封闭剂。在一系列洗涤后,将板与酶缀合的抗体一起温育。另一系列洗涤去除所有未结合的抗体。甲衬底然后加入,产生量热信号。最后,读取板。

因为该测定法使用表面结合进行分离,所以在每个ELISA步骤中重复几次洗涤以除去未结合的物质。在此过程中,必须除去过量的液体,以防止在下一个测定步骤中加入的溶液稀释。为确保均匀性,通常使用专用的垫圈。

ELISA可能非常复杂,包括多个干预步骤,尤其是在测量血液等异质样品中的蛋白质浓度时。整个过程中最复杂和变化的步骤是检测,其中多层抗体可用于放大信号。

一般ELISA程序

一般ELISA程序

四种最常见的ELISA类型

ELISAs可以通过对基本程序的多种修改来执行:直接,间接,三明治或竞争。关键步骤,固定目标抗原,可以通过直接吸附到测定板上或通过附着在板上的捕获抗体间接实现。然后直接检测抗原(酶标记的一抗)或间接检测(酶标记的二抗)。检测抗体通常用碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记。有大量底物可用于用HRP或AP缀合物进行ELISA。底物的选择取决于所需的测定灵敏度和可用于信号检测的仪器(分光光度计,荧光计或发光计)。

在下面讨论和说明的标准测定形式中,其中捕获和检测的差异是关注的,区分特定用于检测步骤的特定策略是重要的。然而,抗原被捕获到板上(通过直接吸附到表面或通过预先涂覆的“捕获”抗体,如在夹心ELISA中),它是检测步骤(作为直接或间接检测),其在很大程度上决定了ELISA的灵敏度。

四种最常见的ELISA类型

四种最常见的ELISA类型

直接ELISA

为了直接检测,通过直接与酶缀合的抗体检测包被在多孔板上的抗原。如果没有针对目标蛋白的市售ELISA试剂盒,这种检测方法是一个很好的选择。

  1. 优点
    • 快速,因为只使用一种抗体和更少的步骤。
    • 消除了二抗的交叉反应性。
  2. 缺点

细胞涂片:用化学键粘附盖玻片上的非粘附细胞

  • 用酶或标签标记可能对一抗的免疫反应性产生不利影响。
  • 为每种特异性ELISA系统标记一抗是耗时且昂贵的。
  • 从一个实验到另一个实验,一级抗体标签的选择没有灵活性。
  • 最小的信号放大。
  1. 间接ELISA

对于间接检测,在两个阶段或层中检测涂覆到多孔板上的抗原。首先应用对抗原特异的未标记的一抗。接下来,酶标记的第二抗体与第一抗体结合。二抗通常是抗物种抗体并且通常是多克隆抗体。间接测定,最流行的ELISA方法,有其优点和缺点:

  1. 优点
    • 多种标记的二抗可商购获得。
    • 用途广泛,因为许多一抗可以在一个物种中制造,并且相同的标记二抗可以用于检测。
    • 保留一抗的最大免疫反应性,因为它未被标记。
    • 灵敏度增加,因为每个一抗包含几个可以被标记的二抗结合的表位,允许信号放大。
  2. 缺点

细胞涂片:用化学键粘附盖玻片上的非粘附细胞

  • 第二抗体可能发生交叉反应,导致非特异性信号。
  • 该程序需要额外的孵育步骤。
  1. 夹心ELISA

夹心ELISA通常需要使用匹配的抗体对,其中每种抗体对抗原分子的不同的非重叠部分(表位)具有特异性。将第一抗体(称为捕获抗体)包被到孔中。然后将样品溶液加入到孔中。第二抗体(称为检测抗体)遵循该步骤以测量样品的浓度。这种ELISA具有以下优点:

  • 高特异性:特异性捕获和检测抗原/分析物
  • 适用于复杂(或粗/不纯)样品:抗原在测量前不需要纯化
  • 灵活性和灵敏度:可以使用直接或间接检测方法
夹心ELISA

夹心ELISA

  1. 竞争性ELISA

该ELISA试剂盒具有竞争性。竞争性ELISA,也称为抑制ELISA,是基于表面/板的测定,其中板用对目标分子具有反应性的捕获抗体包被。将样品(含有目的天然分子)和酶缀合的重组蛋白(竞争分子)加入到包被的孔中。由于每个孔中酶缀合分子的量是恒定的,样品中天然分子的水平将决定酶缀合分子与天然分子的结合比。孵育期后,洗掉任何未结合的抗体。向每个孔中加入酶底物(例如,用于HRP的TMB)并将其转化为蓝色沉淀物,其量与孔中酶的量成线性比例。然后通过加入酸终止溶液使沉淀物变成黄色,并在450nm处读取黄色沉淀物的浓度以获得光吸收(OD值)。然后通过将每个样品孔与标准曲线进行比较,将OD用于计算每个孔中感兴趣的分子的量。使用相同的原理产生标准曲线,但是不是添加样品,而是将一系列具有已知浓度的重组分子添加到6-8个孔中。

竞争性ELISA

竞争性ELISA

不同ELISA类型关键步骤的总结

间接直接三明治竞争的
Capture Ab CoatingXXX
抗原涂层X
闭塞
样品(抗原)孵育XX
初级Ab孵化
二次抗体孵化X
基材准备
信号检测
数据分析

ELISA数据解释

ELISA分析产生三种不同类型的数据输出:

  1. 定量:ELISA数据可以与标准曲线(已知的纯化抗原的连续稀释)比较来解释,以精确计算各种样品中抗原的浓度。
  2. 定性:与不含抗原或无关对照抗原的空白孔相比,ELISA也可用于实现是或否答案,表明样品中是否存在特定抗原。
  3. 半定量:ELISA可用于比较测定样品中抗原的相对水平,因为信号强度将直接随抗原浓度而变化。

通常用光密度(或荧光)对浓度绘制ELISA数据,以产生如下所示的S形曲线。使用已知浓度的抗原产生标准曲线,然后通过与标准曲线的线性部分比较,将该数据用于测量未知样品的浓度。事实上,曲线的相对较长的线性区域使得ELISA结果准确且可重复。未知浓度可以直接在图表上或通过曲线拟合软件确定,该软件通常在ELISA板读数器上找到。

浓度绘制ELISA数据

浓度绘制ELISA数据

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