DNA文库制备_DNA文库筛选

DNA文库制备方法|过程|技术|DNA文库筛选

DNA文库制备

如果目标是创建基因组DNA文库,第一步是提取基因组DNA(请参阅DNA提取方案)。而产生cDNA文库的第一步依赖于mRNA提取(请参阅 RNA提取方案)。然后,通过逆转录酶的催化活性将mRNA转化为cDNA(请参阅将mRNA转化为cDNA的方案)。

一旦获得cDNA,就需要使用限制酶以在载体和DNA片段中产生互补末端。

DNA消化:

  • 在200μl管中加入2μlcDNA或基因组DNA
  • 加入15μlDEPC处理过的水
  • 加入2μl限制酶缓冲液(10x)
  • 加入1μl限制酶
  • 在适当的温度下孵育2小时,相应地选择限制酶
  • 在高温下灭活限制酶(通常在65ºC下20分钟)

矢量消化:

  • 在200μl管中加入2μl载体(100 ng /μl)
  • 加入15μlDEPC处理过的水
  • 加入2μl限制酶缓冲液(10x)
  • 加入1μl限制酶
  • 在适当的温度下孵育2小时,相应地选择限制酶
  • 在高温下灭活限制酶(通常在65ºC下20分钟)

克隆:

  • 在200μl管中加入5μl消化的cDNA
  • 加入3μl消化的载体
  • 加入1μl连接酶缓冲液(10x)
  • 加入1μl连接酶
  • 在4ºC孵育过夜
  • 使用5μl连接溶液转化宿主感受态细胞
  • 根据所用载体的选择标记,用选择标记(例如氨苄青霉素,卡那霉素)将细胞铺在培养基中。

DNA文库筛选

为了在功能上表征和鉴定新基因,可以进行生理学测试以检测宿主生物和携带DNA文库的DNA片段的宿主生物之间的表型差异。通常,生长测试是通过在不同培养基配方和/或不同温度下培养细胞来实现该任务的最常用方法。

一个现实生活中的例子是使用可再生碳源,旨在生产生物燃料,作为最近寻找化石燃料替代品的倡议。在该生物过程中使用的大多数生物,如大肠杆菌,不能在这些底物中生长,即木聚糖。但木糖的降解产物木糖可以被工业微生物同化和代谢(并用于生产生物燃料)。因此,在富含木聚糖的底物中生长的微生物样品用于提取RNA并如前所述制备cDNA文库,并在大肠杆菌中转化。感受态细胞。随后将转化的细胞接种在基于木聚糖作为唯一碳源的基本培养基中。该程序将允许阳性选择转化体。只有携带能够将木聚糖降解为木糖的酶的载体中携带基因的转化体才会在平板中生长。然后提取转化体的载体并测序。这将使我们能够确定哪些基因有助于在木聚糖培养基中生长。

 

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