DNA和RNA提取和纯化

DNA和RNA提取和纯化实验方法、步骤、介绍

DNA和RNA提取和纯化介绍

基因组DNA(gDNA)和总RNA通常是分子生物学实验的遗传元件,因为它们是生物体中遗传信息的主要来源。

基因组DNA和总RNA提取具有直接的方法,仅需要细胞裂解即可完成任务。但是,建议您考虑实验室研究中使用的生物类型。一些生物体的细胞具有细胞壁结构,为细胞提供额外的保护。对于大多数酵母,植物和细菌物种来说就是这种情况。对于这些生物,建议在破坏质膜之前包括额外的细胞裂解步骤。该步骤通常是破坏细胞壁的酶促或机械过程。需要纯化DNA和RNA分子以避免与其他细胞内组分(例如蛋白质和代谢物)的污染。一些常用的DNA和RNA纯化方法是用苯酚 – 氯仿或异丙醇沉淀,

但是,如果您的目标DNA是质粒,您应该调整您的程序以确保质粒DNA(pDNA)与gDNA分离。碱性裂解是实验室中使用的最新方案。裂解缓冲液在其组成中具有氢氧化钠和SDS,其将负责gDNA和pDNA的变性。随后,添加中和缓冲液以使pDNA复制而不是gDNA复制。由于gDNA的大小,与pDNA不同,再次复制要困难得多。然后,相同的gDNA纯化程序可用于pDNA纯化。

如果您的研究专注于基因表达分析,那么您应该针对总RNA。用于提取和纯化gDNA的相同程序可用于总RNA纯化,但需要一些额外步骤,您将在以下RNA提取和纯化方案中看到。南博屹生物建议根据您的初始样品来源准备以下样品制备方案。

(电询我们寻求帮助,全国免费咨询热线:400-080-3779)

 

DNA提取和纯化

试剂:

  • 裂解缓冲液:1%SDS,5M NaCl
  • 异丙醇
  • 70%(v / v)乙醇
  1. 将用于DNA提取的细胞收集到2ml管中。
  • 注意:如果您使用细胞悬浮液,您可以直接进入裂解程序。如果您正在使用样品,例如难以均质化的细胞组织,您可以使用液氮来制造均匀的细胞悬液。当您有细胞悬液时,您应该注意样品的膜结构。通常,对于具有细胞壁的细胞,建议进行预裂解处理以降解该屏障。您可以使用酶法或机械法。
  1. 将1ml细胞悬浮液加入2ml管中
  2. 加入100毫克5毫米玻璃珠并在15分钟内涡旋。
  • 注意:或者,您可以使用10U的裂解酶(用于真菌样品)或10U的溶菌酶(用于革兰氏阴性菌)。
  1. 使用离心机以最高速度旋转细胞悬浮液1分钟,
  2. 弃去上清液并重悬于1000μl裂解缓冲液中。
  3. 以最高速度旋转1分钟
  4. 将上清液转移到新的2ml管中。
  5. 加入500μl异丙醇并轻轻混合。
  6. 将混合物置于冰上5分钟。
  7. 以最高速度旋转1分钟,
  8. 弃去上清液并用500μl70%(v / v)乙醇洗涤DNA沉淀。
  9. 在1分钟内以最高速度再次旋转。
  10. 丢弃上清液。
  11. 让颗粒风干,将2毫升管倒置在纸巾中。
  12. 将DNA溶解在50μl超纯DEPC H 2
  13. 使用Nanodrop设备获取DNA浓度和质量。
  • 注意:核酸吸收260 nm的紫外线,而蛋白质和酚类化合物吸收280 nm的紫外线。许多有机化合物以及苯酚,TRIzol和离液盐在230nm附近具有强吸收。A260 / 280比率用于识别蛋白质污染。对于RNA和DNA,A260 / 280比率应分别约为1和1.8。A260 / 230比率表明存在有机污染物,例如苯酚,TRIzol,离液盐和其他芳族化合物。260/230比率低于1.8的样品含有大量这些污染物。
  1. 将DNA样品保存在4°C即可立即使用,或-20°C保存以备长期保存。

RNA提取和纯化

*注意:在此协议期间,始终使用新手套和无RNase材料。

  1. 将细胞收集到2ml管中。
  • 注意:在使用细胞悬浮液的情况下,您可以在添加裂解缓冲液之前直接进入离心机步骤。虽然如果您使用的样本,如难以均质化的细胞组织,您可以使用液氮来制造均匀的细胞悬液。对于其中细胞具有细胞壁的样品,将1ml细胞悬浮液加入2ml管中并加入100mg 0.5mm玻璃珠并涡旋15分钟。
  1. 使用离心机以最高速度旋转细胞悬浮液1分钟,
  2. 弃去上清液,重悬于1 ml预热至65ºC的裂解缓冲液中。
  3. 加入900μl酸性酚:氯仿并涡旋10秒。
  4. 将2ml管在室温下放置在工作台上10分钟。
  5. 在4°C下以最高速度旋转10分钟
  6. 将上清液转移到新的2ml管中
  7. 加入3体积的5M乙酸钠和0.7体积的酸性酚:氯仿。
  8. 轻轻混合管并在冰上孵育10分钟。
  9. 在4℃下顶部旋转10分钟
  10. 将上清液转移到新鲜的2ml管中。
  11. 加入1体积的3M乙酸钠和相同体积的异丙醇。
  12. 将管在-20°C孵育1小时。
  13. 在4℃下以最高速度旋转10分钟并弃去上清液。
  14. 用500μl乙醇(70%)洗涤沉淀
  15. 在4°C下以7,500 g离心5分钟。
  16. 将颗粒风干5-10分钟
  17. 溶于25μl无RNase的水中。
  • 注意:为了进一步使用RNA进行表达分析,强烈建议用DNA酶(一种消化DNA的酶)处理RNA样品。
  1. 加入1ml管10ug RNA,
  2. 加入5μlDNase缓冲液,
  3. 加入1μlDNA酶,用无RNase水将体积增加至50μl。
  4. 在37ºC孵育30分钟。
  5. 加入.500μl乙醇(70%)
  6. 在4°C下以7,500 g离心5分钟。
  7. 将颗粒风干5-10分钟
  8. 使用nanodrop设备获取RNA浓度和质量
  9. 将RNA样品保存在4°C的25μl无RNase水中,立即使用,或-20°C长期保存。
  • 注意:为了去除在进一步的qRT-PCR实验中可以破坏cDNA分子的DNA酶,添加1ul的DNase抑制剂。

 

南博屹生物提供DNA和RNA提取和纯化服务,详情电询400-080-3779

Posted in 技术文章 and tagged , , .

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注