还在为“实验方案”而头疼吗?

对于科研工作者而言,我想“实验方案”这四个字应该不会感到陌生吧!对于课题实验而言,一个好的实验方案是成功的关键因素,会起到事半功倍的效果。虽然只有简短的四字,但有时候却让人焦头烂额,不知道从何入手。小编不才,借此机会简要的理一下思路,抛砖引玉。如有“大牛”经过,烦请指点一二。

目前,生物医学方向的研究热点依然逃脱不了miRNA、lncRNA以及circRNA三大系列,绝大部分都是与癌症或肿瘤有关联,在人体内的作用机制还没有得到完整的阐述,有待进一步的深入研究。接下来本文以miRNA为例,来设计一个实验方案。

【随便选取一个miRNA以及某种癌症】—-以miRNA-142-5p和肺癌为关键词。

一、明确研究对象:miRNA-142-5p,肺癌。

有了这两个对象还不够,还缺少一个重要的因素,那就是miRNA-142-5p的靶基因,因为miRNA一般都是通过作用靶基因来作用于癌症。

1、靶基因预测

通过靶基因预测网站,我们得知miRNA-142-5p的靶基因有很多,这时小伙伴们是不是有个疑惑,这么多靶基因,我该选哪个呢?不要慌,小编教你一个方法:因为主题是与癌症肿瘤相关,因此我们可以查找与cancer/tumor相关的靶基因。通过刷选,我们得知miRNA-142-5p的靶基因为FAT3、TP53INP1和TNFAIP3。

【靶基因预测网站:

microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/home.do)

和TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_61/)】

2、双荧光素酶报告基因检测——验证预测的靶基因

二、对象明确后,接下来就要开始进入正题了。。(实验方法)

一般而言,与肿瘤或癌症相关的实验方法包括三部分:临床实验、细胞实验以及体内实验(小鼠造模)。

临床试验

选取肺癌组织及其邻旁健康组织(对照组),通过RT-qPCR检测组织内miRNA-3156-5p的表达,以观察miRNA-142-5p在肺癌组织中是高表达还是低表达。

细胞实验

1、细胞系

肺癌细胞系:H460、A549、HCC827、H1975和H1299;正常肺上皮细胞系:BEAS-2B和HBE。采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。

2、VZET和EMT相关基因的表达情况分析

在肺癌细胞系和正常的肺上皮细胞系中利用RT-qPCR 和Western blot检测miRNA-142-5p、FAT3、TP53INP1和TNFAIP3等相对表达量。

3、转染

以对数生长期的肺癌细胞/正常的肺上皮细胞为转染对象,转染miRNA-142-5p(实验组)【实验组分为miRNA-142-5p过表达组(pc-miRNA-142-5p)和敲低组(siRNA)】,阴性对照组(siNC、pcNC),以及空白对照组

【分为5组:siRNA、pc -miRNA、siNC、pcNC、Control group】。

其中关于敲低/沉默组(siRNA),可以设计两到三条对应siRNA序列。

4、RT-qPCR和Western-blot

检测转染miRNA-142-5p后靶基因(FAT3、TP53INP1和TNFAIP3)的表达情况。

5、转染后要检测miRNA-142-5p对细胞的影响,论文中常见的一些细胞实验包括细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、自噬等,但各自采用的方法却不一样,接下来就简单的介绍一下:

细胞增殖——MTT/MTS/CCK-8等实验;

细胞迁移和侵袭——Transwell实验/划痕愈合实验;

细胞凋亡——流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期、Caspase3/7活性检测、ROS(活性氧)检测、MMP(线粒体膜电位)检测等;

细胞自噬——通过免疫组化/western-blot检测自噬相关标志物(LC3和Beclin-1)的相对表达量。

6、相关信号通路分析——细胞凋亡和自噬过程都是伴随着相关的信号通路(singling pathway)。

Caspase-3/Caspase-9 singling pathway:

细胞凋亡被认为是抑制细胞生长的一种方法,Caspase-3/-9是细胞凋亡的两个关键成员。凋亡相关因子包括Caspase-3,Caspase-9,Bcl-2和Bax。Western-blot和RT-qPCR检测对应的蛋白或mRNA:Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax。

PI3K/Akt/mTOR singling pathway:

PI3K/Akt/mTOR信号通路在肿瘤中研究较多。在转染miRNA-142-5p后,结合相关通路抑制剂或激活剂(PI3K的抑制剂:LY294002;mTOR抑制剂:雷帕霉素(RAP);PI3K/Akt/mTOR通路的激活剂:胰岛素insulin),通过western-blot检测相关蛋白的表达量,包括Akt、p-Akt(磷酸化)、mTOR、p-mTOR。

动物实验

成瘤实验(Tumor formation assay)——小鼠体内实验【实验验证】

从肺癌细胞系中找出miRNA-142-5p表达最低的那个细胞系,然后过表达miRNA-142-5p;或者找出miRNA-142-5p表达最高的那个细胞系,然后进行RNAi技术,敲低/沉默miRNA-142-5p。

转染的细胞通过皮下注射到BALB/c裸鼠中,15 d左右后,处死小鼠,收获肿瘤并测量肿瘤的重量及大小。

理论上讲,实验方法越多,内容越饱满,相对而言越容易发高分的文章,当然,这还得考虑个人实际情况,尤其是基金的预算以及您想要发几分的文章,不可盲目。。。

关于几分的文章对应哪些实验方案,在这里小编简单的介绍一下:

0-1分:

单个细胞系,单组转染miRNA(根据细胞系中miRNA的表达情况来确定是过表达还是敲低转染),做一些简单的细胞实验即可(细胞增殖、迁移/侵袭、细胞凋亡–流式细胞检测凋亡率)。

1-3分:

临床组织样本和多个细胞系(2-3个),单组转染miRNA(根据细胞系中miRNA的表达情况来确定是过表达或者敲低转染),丰富相关细胞实验,比如说细胞凋亡,除了利用流式细胞仪检测细胞凋亡率之外,还可以检测细胞周期、Caspase3/7活性、MMP检测、ROS检测等。

3-5分:

临床组织样本和多个细胞系(3-5个);两种miRNA转染形式:过表达和敲低/沉默(其中siRNA可以设计2-3条对应序列);研究相关信号通路以及动物实验(小鼠成瘤)验证miRNA的作用。

5-7分:

这算是一个高分文章了,所以思路相对要变一点,不能按照传统模式下去。与5分以下文章相比,除了一些常规的研究之外,具有一个很重要的创新点:利用生信分析——基因表达微阵列(Gene expression microarray assay)检测肿瘤组织与邻近正常组织差异表达的miRNA和基因,通过表达以及敲除/沉默两种手段进行转染miRNA或相对应的基因。除此之外,在细胞系以及细胞实验方法的选择上也更多,以及相关的信号通路研究和小鼠成瘤验证实验也是必不可少的。

不管您发几分的文章,有几个实验环节是必不可少的,第一个就是靶基因的预测和双荧光素酶报告基因检测;第二个就是RT-qPCR和western-blot,检测相关mRNA和蛋白的表达情况。

好了,今天小编就先介绍到这里了,如果您有什么想法或者问题,欢迎留言或者直接联系沟通哦!!!

 

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