如何运用CRISPR-cas9基因编辑技术发高分文章?

最近“基因编辑婴儿问世”事件引起了业内强烈的轰动,在该项研究中贺建奎采用了CRISPR-cas9技术对胚胎进行编辑,用5微米、约头发二十分之一细的针把Cas9蛋白和特定的引导序列注射到还处于单细胞的受精卵里,来达到预防HIV病毒的目的。

关于CRISPR-cas9技术,大家应该都不陌生,我们先来了解一下它的原理:

CRISPR系统最早是细菌在长期演化过程中形成的一种降解入侵病毒的DNA或其他外源DNA的免疫防御:当病毒把自己的基因整合在细菌的DNA上,企图利用细菌的复制功能来为自己服务的时候,细菌就进化出了CRISPR系统,把病毒基因从自己的染色体上切除,同时将这些信息录入自己的基因组,当病毒再次入侵时该系统起到识别入侵的作用可再次切除病毒的DNA,清除病毒的外来入侵基因。这与我们人体的免疫过程大致相同。

目前应用最广泛的是CRISPR-cas9技术: Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。

而关于CRISPR-cas9技术的应用,我们来介绍一篇高分文章,给大家做一下参考:

该文章发表在《Molecular Cell》期刊上,影响因子14.248。

下面一起看下文章的具体内容:

1. 为了建立一套完整的转录后调控miRNA生物合成的蛋白质图谱,研究人员收集了72名人类miRNA的前体,包括转录后调控的miRNA。

研究人员采用STAR方法和不同的量化方法,发现不同的细胞类型之间加工中间体的水平可能有很大的差异,miRNA加工的转录后调节是一个广泛且具有细胞类型特异性的现象。

2. 为了确定与72个前miRNAs特异相互作用的调节蛋白,作者采用质谱法,凝胶电泳法等在体外进行了相互作用的研究,发现了180个蛋白质可以与miRNA前体的单个或一个子集有优先或特异的结合。

 

3. 作者又进行了生物信息测试,结果显示180个蛋白质中有162个与“RNA结合”相关,另一些则与‘RNA处理’或‘剪接’有关。

4. 作者选取了一组候选基因检测其在细胞中的表达,证实了作者在质谱分析中观察到的结合特异性,之后采用RIP法等多种方法确认了大量的候选蛋白质。

5. 为了识别RBPs所接触的miRNA发夹上的序列区域和基序,作者分析了与之结合的miRNA发夹,还鉴定了一组与特定的pri-miRNA结合的蛋白质。

6. 接下来作者采用了RNAi或CRISPR/CAS技术进行了敲除实验,作者首先进行了C9ORF114敲除,因为有报道其与与mRNA相互作用,之后在筛选中发现一对高度相似的两个RBPs PUM 1和PUM 2,敲除它们检测相关pri-miRNA的表达,结果显示轻度上调,表明其抑制作用为转录后效应;

之后做了另外一个敲除实验,敲除了ZC3H7A并检测相关miRNA的表达,结果表明ZC3H7A具有高度的保守性和结合特异性,在miRNA的调节中可能具有冗余功能,并加以验证。

7. 作者做实验确定了ZC3H10和PRI-miR-143之间具有直接特定的相互作用,之后为了阐明其分子机制,进行了功能损失实验,结果表明其机制不局限于细胞背景,并且对CELF 1和CELF 2也进行了敲除,数据表明,核RBPs CELF 1/2也可能在DROSHA处理水平上起作用。

8. 最后作者又敲除了TRIM 71基因,并利用CRISPR/Cas9技术使TRIM 71突变,经过实验证明之后发现通过转录后调节miRNA水平可以直接影响靶基因的表达。

实验完成,我们来看作者是如何运用CRISPR技术的:作者筛选出可能调控miRNA成熟的RBP蛋白之后,利用CRISPR技术对RBP进行敲除看其是否对miRNA成熟过程有影响,例如敲除C9ORF114,先设计sgRNA序列,构建转染载体pX330-gRNA,用lipo3000方法转染细胞,之后用RT-PCR和WB方法检测C9ORF114的表达水平。

你学会了吗?另外,昨日国家自然科学基金委员会发布公开信,谴责了贺建奎副教授“人类胚胎基因编辑婴儿”的行为,小博认为,科学技术进步固然可以推动人类社会的发展,但是科学伦理建设也会面临着越来越多的新挑战,我们应以负责任的态度去践行科研中的伦理规范!

• END •

Posted in 行业动态.

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注