关于lncRNA,科研大神们是怎么做的?

上周我们介绍了几种关于circRNA的研究思路,那同样的,我们耳熟能详的非编码RNA除了有miRNA,circRNA之外,还有lncRNA,接下来我们就来介绍几种关于lncRNA的研究思路(敲黑板,划重点,快拿个小本本记下来)。

今天我们介绍的是由南京医科大学的研究人员发表的关于胃癌和lncRNA的一篇文章:A novel long noncoding RNA HOXC-AS3 mediates tumorigenesis of gastric cancer by binding to YBX1 ,这篇文章发表在《Genome Biology》杂志上,影响因子13.214分。

技术路线图:

下面我们来看文章的具体内容:

1. 作者从GEO数据库下载原始芯片数据进行分析,通过胃癌RNA表达谱分析发现HOXC-AS3明显高表达,为了验证这个结果,又对TCGA数据库中分析胃癌lncRNA的RNA-seq数据,发现HOXC-AS3在组织中依然高表达;

2. 作者收集了112例胃癌患者的样本,运用race技术确定HOXC-AS3的完整序列,HOXC-AS3在胃癌组织中表达高度上调,且与临床病理因素例如组织学分级、肿瘤浸润深度、淋巴结转移以及预后不良有关;

之后作者想要探讨HOXC-AS3高表达的机制,运用生物信息学的网站分析后得出结论:在HOXC-AS3的启动子区发现H3K4me3和H3K27Ac高富集和重叠峰,通过CHIP实验分析,发现H3K4me3和H3K27Ac在HOXC-AS3启动子区与正常组织相比在胃癌组织中有所增加。这表明H3K4me3和H3K27的增加可部分激活HOXCAS3导致其在胃癌组织中高表达;

3. 接下来就是普遍的关于肿瘤癌症的研究思路,作者进行了细胞实验,通过过表达/敲除HOXC-AS3检测细胞凋亡与增殖,结果表明:HOXC-AS3过表达会促进癌细胞增殖,敲除HOXC-AS3会诱导癌细胞凋亡;

4. 然后作者又构建了动物模型,经过动物实验证明HOXC-AS3对癌细胞增殖和迁移的调节;

5. 如果实验做到这里,那也没什么好讲的,就是研究非编码RNA与癌症之间联系的普遍套路嘛,接下来,重点来了!这也是文章的加分项!

作者对HOXC-AS3的作用机制进行了探讨并做实验来加以验证,作者首先推测HOXC-AS3在顺式细胞中起作用,做了敲除实验后发现数据未显示,亚细胞分裂定位分析显示HOXC-AS3在细胞核中的表达与胞浆相比显著增加,说明HOXC-AS3可能在转录水平上起主要调节作用;

之后作者选取了已知的有重要作用的转录因子YBX1为研究对象,并做了三次独立的RNA pull-down实验来验证HOXC-AS3与YBX1之间具有相互作用,并进行RNA免疫沉淀实验来验证这个结论;

结果表明HOXC-AS3可能与YBX 1结合,通过转录调控其他基因参与胃癌的发生;

6. 作者的研究没有就此止步,而是再次设计实验来验证上面得出的结论:HOXC-AS3与YBX 1结合是否通过转录调控其他基因来参与胃癌的发生;

作者敲除了HOXC-AS3 / YBX1,结果显示有3122个基因被显著上调或下调,又对这些结果进行了GO分析和GSEA分析,发现其能抑制多个细胞增殖的相关基因表达,又通过CHIP实验证实敲除HOXC-AS3后,YBX1与大多数调节基因启动子之间的结合减弱。结果表明HOXC-AS3可能是通过调节YBX1与其靶基因启动子区域之间的关联来发挥调控作用的;

7. 最后作者又选取变化显著的HOXC-AS3 和 YBX1的共同靶标HDAC 5进行进一步的分析,结果表明HOXC-AS3与胃癌组织中HDAC5的表达呈正相关。分别设置了HOXC-AS3敲除实验、YBX1敲除实验以及HDAC5敲除实验,结果表明HOXC-AS3至少部分通过调节HDAC5表达发挥功能。

这样,一篇13分的文章就新鲜出炉了。小博不得不感慨,实验内容是真的多啊,不仅多,研究还深入。

对于非编码RNA与肿瘤癌症之间联系的研究来说,普通的套路就是对其进行验证,看其是否促进或抑制癌症细胞增殖或凋亡,之后对作用机制进行推测和探讨,再做个敲除实验或者动物实验什么的验证一下就完了。

但是我们看科研大神们的研究,有没有学习到什么呢?有没有让你恍然大悟的感觉呢?欢迎在评论区留言一起探讨~

参考文献:X, H., et al. (2018). “A novel long noncoding RNA HOXC-AS3 mediates tumorigenesis of gastric cancer by binding to YBX1.%A Zhang E.” Genome biology 19(1): 154.

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